鋅摻雜氧化鋯的制備及其抗菌性能研究

朱曉東

（上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234)

由于遺傳因素、意外創傷、細菌感染所導致的牙體缺損、牙面不齊以及牙周炎、齲齒等[1]是口腔常見的疾病。其中，由于細菌感染所導致的“齲齒”被稱為世界第三大非傳染性疾病。口腔疾病雖然不會直接影響到人們的生命安全，但是卻影響著人們的生活質量，經久不治的話，會間接影響著人們的身體健康。臨床研究表明，由于細菌感染所造成的牙齒修復失敗也是不可忽視的問題。

氧化鋯作為無機生物材料研究應用以來，因其具有良好的生物相容性、化學穩定性等性能，被廣泛應用于齒科修復領域[2]。其中，釔穩定的四方型氧化鋯（Y-TZP）因為具有較高的穩定性，得到了廣泛的關注[3]。鋅元素作為一種常見的抗菌元素，能夠有效抑制口腔細菌形成。例如，谷海晶等人發現，鋅鹽釋放出的Zn2+具有一定的氧化還原性, Zn2+進入細胞后與DNA 反應并破壞酶化合物, 抑制細菌產酸，從而具有抑制菌斑形成、抗菌的作用, 且不同濃度Zn2+抗抑菌效果不同, 同時會影響鈣磷灰石晶體形成的類型[4]。

本研究采用化學沉淀法制備納米級鋅摻雜氧化鋯粉體，研究了合成條件對粉體形貌和物相的影響規律，并探究了隨著鋅摻雜量的增加，合成氧化鋯對大金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性，以及其生物相容性的研究。

1 實驗材料與方法

1.1 Zn-ZrO2 的制備

將八水合氯氧化鋯（ZrOCl2·8H2O）溶于蒸餾水中配置成0.5mol/l 的溶液，然后加入六水合硝酸釔（Y（NO3）3·6H2O）和六水合硝酸鋅，其中控制釔含量為氧化鋯含量的3mol%，鋅含量為氧化鋯含量的1wt%、1.5wt% 和2wt%。通過攪拌器將混合體系攪拌完全，緩慢滴加氨水調節溶液pH 為10 左右，得到白色沉淀物，再將該懸浮液室溫下靜置沉淀12h。沉淀物經過過濾，用水和無水乙醇清洗，100℃的條件下烘干。最后700℃煅燒兩小時，得到納米級Zn-ZrO2粉體。

1.2 物相和形貌表征

用X 射線衍射儀（型號D/max2550V，日本）對Zn-ZrO2粉體進行分析并確定其物相成分；采用場發射掃描電子顯微鏡（型號S-3400，日本）觀察Zn-ZrO2粉體表面形貌。

1.3 抗菌性測試

抗菌性測試選用的細菌是最具代表性的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌的培養基采用營養肉湯（NB）培養基。

1.3.1 細菌增殖實驗

細菌稀釋至濃度為1×107cfu/ml，接著每0.02g 滅菌后的樣品中接種500μl 的菌液，并在37℃培養箱中分別培養12h 和24h。再向菌液中加入Alarm Blue 熒光染色劑（菌液與染色劑體積比為9 ：1）。繼續培養2h，之后再取100μl 菌液于96 孔板中，采用分光光度計檢測其熒光強度，檢測范圍在560nm 到590nm。

1.3.2 細菌形貌觀察

將樣品粉末用壓片機壓制成Φ7mm×3mm 大小的圓片，高溫滅菌后與500μl 菌懸液共培養24h，菌液濃度為1×107cfu/ml。之后將與菌液共同培養后的樣品片浸入濃度為2.5% 的戊二醛，并置于4℃的條件下避光保存12h。接著依次采用體積比為30%，50%，75%，90%，95%，100% 的乙醇對樣品片進行脫水處理，并用六亞甲基硅烷/ 乙醇溶液（1:2，2 ：1（體積比）和純六亞甲基硅烷）依次干燥10-20min。通風干燥后表面噴金，用電子顯微鏡觀察樣品表面的細菌形貌。

1.3.3 細菌涂板

將兩種特定濃度的細菌懸液分別接種在含有0.02g 粉體的24 孔板內，在37℃條件下培養24h，培養后的的菌懸液分別按10的冪次方稀釋并均勻地涂在相應的培養皿上，37℃培養箱放置24h。24h 后取出瓊脂板置于凝膠成像系統設備的暗室中拍照。

1.4 生物相容性實驗

樣品的細胞相容性實驗選用人牙齦成纖維細胞（HGFs）進行，使用DMEM·F12 培養基，按照ISO10993.5 中所推薦的材料與浸提介質比例進行材料浸提制備[5]。

1.4.1 細胞培養

液氮中取出細胞并在37℃下解凍，之后在離心機中離心處理5min，轉速為1000r/min。去除上清液，用移液槍加入新鮮培養基并吹打使其分散均勻，吸取適量的細胞懸浮液于培養皿中，在37℃的培養箱中培養3 天。

1.4.2 樣品浸提液的制備

將滅菌后的不同鋅摻雜量的氧化鋯粉末按照0μg/ml、50μg/ml、250μg/ml 和500μg/ml 的 粉 體 與 介 質 比 例 浸 泡 在DMED·F12 培養基中。放置24h 后，無菌條件下過濾，取上清浸提液備用。

1.4.3 觀察細胞形貌

先將滅菌后的透明玻璃片放在24 孔板中，再將HGFs 接種于孔板中，接種密度為2.5×104cfu/ml，37℃條件下培養24h。之后去除培養液，加入樣品浸提液繼續培養24h，浸提液濃度為250μg/ml。之后再廢棄原培養基，用緩沖液將載有細胞的玻璃片清洗兩遍，加入2.5% 戊二醛固定，并放在4℃冰箱內避光保存12h。之后采用不同濃度梯度的乙醇依次脫水處理。再用六亞甲基硅烷/ 乙醇溶液（1:2，2:1 和純六亞甲基硅烷）處理15min。最后室溫下通風干燥，表面噴金后用電子顯微鏡觀察表面細胞形貌。

2 結果與分析

2.1 Zn-ZrO2 粉體的物相及形貌表征

圖1 不同含量鋅摻雜氧化鋯在20o-80o 的XRD 圖。

圖2 不同含量鋅摻雜氧化鋯產物的形貌圖。

圖1 中顯示，鋅摻雜氧化鋯粉體依舊是四方相為主的氧化鋯。在鋅摻雜氧化鋯產物的形貌圖2 中可見，不同含量鋅摻雜氧化鋯粉體都是粒度在幾十納米左右的顆粒，且分散性較差。

2.2 抗菌實驗

Zn-ZrO2粉體對大腸桿菌的抗菌結果：

圖3 （A）各組鋅摻雜氧化鋯對大腸桿菌的細菌增殖圖；（B）大腸桿菌與樣品片共培養24h 后的細菌形貌圖；（C）大腸桿菌與樣品粉末共培養24h 后的細菌涂板圖。

圖4 （A）各組鋅摻雜氧化鋯對金黃色葡萄球菌的細菌增殖圖；（B）金黃色葡萄球菌與樣品片共培養24h 后的細菌形貌圖；（C）金黃色葡萄球菌與樣品粉末共培養24h 后的細菌涂板圖。

在圖3（A）和4（A）細菌增殖圖中，未摻鋅的氧化鋯相比于空白對照組仍具有一定的抗菌性。同時，相比于0%Zn-ZrO2組，1%Zn-ZrO2、1.5%Zn-ZrO2和2%Zn-ZrO2組樣品對兩種細菌同樣顯示出了明顯的抗菌效果。在3（B）中大腸桿菌的形貌圖中可見，鋅的摻雜導致大腸桿菌形貌上不同程度的變化。而4（B）中金黃色葡萄球菌同樣也出現不同程度的凹陷和破裂現象。表明了鋅摻雜氧化鋯會破壞細菌結構。在3（C）的細菌涂板實驗中，相比于其他組，1.5%Zn-ZrO2組瓊脂板中的菌落數最少，空白對照組的菌落數最多，其他組次之。而在4（C）中，同樣是空白對照組菌落數最多，0%Zn-ZrO2組次之，但是1%Zn-ZrO2、1.5%Zn-ZrO2和2%Zn-ZrO2組之間的菌落數差異不明顯。總之，鋅的摻雜會導致氧化鋯抗菌性的提高，但是不同摻雜量之間的抗菌性差異還不太明顯。

2.3 Zn-ZrO2 生物相容性實驗

圖5 的細胞形貌圖顯示，在與細胞共培養24h 后的0%Zn-ZrO2和 1%Zn-ZrO2樣品表面上，細胞數量居多且大都鋪展開來，而在1.5%Zn-ZrO2組樣品中，大量細胞還尚未鋪展。在2%Zn-ZrO2組樣品中，細胞出現數量明顯減少的現象。表明當鋅摻雜量過高時，對HGFs 的生長具有一定的抑制作用。

圖5 250μg/ml 樣品浸提液分別與HGFs 共培養24h 之后的細胞生長圖。

3 小結

（1）以六水合硝酸鋅為鋅源，采用簡單的化學沉淀法將其加入到氧化鋯的制備過程中，合成了納米級鋅摻雜氧化鋯粉體，XRD 數據顯示鋅摻雜氧化鋯仍然是以四方相為主題的材料，且粒徑均分布在50nm 左右。

（2）通過改變鋅的摻雜量，得到了鋅摻雜氧化鋯對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌不同程度的抗菌效。

（3）將所合成的鋅摻雜氧化鋯粉體應用于對HGFs 的生物相容性實驗中，從樣品表面的細胞生長情況來看，當鋅的摻雜量達到1.5% 時，對HGFs 具有明顯的抑制作用，當摻雜量為2% 時，細胞數量明顯減少。