水稻田土壤鐵錳氧化菌的分離與鑒定

王娟娟 闕天洋 胡珈瑋 趙雨涵 錢曉晴 張振華

摘要：鐵、錳氧化物可以富集、鈍化重金屬，在一定程度上阻止其進入水稻根系，對于土壤污染修復，降低水稻污染風險有重要的生態意義。采用改良纖毛菌培養基，單菌落稀釋轉接法分離純化鐵錳氧化菌，分析相關菌株的形態特征，對菌株的16S rRNA基因序列進行測定分析，對其及產物進行電鏡掃描與能譜分析，并分析產物對重金屬鎘的吸附效率。結果分離得到具有鐵錳氧化功能的菌株5株，形狀為橢球至短桿狀，均為不動桿菌屬（Acinetobacter）。能譜分析表明，除MOB4之外菌株樣品均有明顯Fe和Mn波峰，以及O波峰，推斷有大量鐵錳氧化物存在。液體培養表明，接種菌株可使培養液中的鎘含量下降35.25%，下降率遠高于對照。綜上所述，通過篩選獲得菌株為不動桿菌屬，具有氧化鐵、錳的功能，并可能促進介質中氧化鐵的生成，進而提高對介質中溶解態重金屬鎘的吸附。

關鍵詞：水稻田;鐵錳氧化細菌;篩選;鎘吸附;不動桿菌屬

中圖分類號：S182?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0243-06

收稿日期：2021-07-05

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：41701093）;中國博士后基金（編號：2017M611928）;國家重點研發計劃課題（編號：2017YFD0200107）。

作者簡介：王娟娟（1979—），女，江蘇泗洪人，博士，副教授，主要從事環境微生物學研究。E-mail：wangjuanjuan@yzu.edu.cn。

通信作者：張振華，博士，研究員，主要從事農業資源與環境學研究。E-mail：zhenhuaz70@hotmail.com。

鐵（iron，Fe）和錳（manganese，Mn）是地殼中占比較大的2種過渡金屬元素。兩者生物、化學性質均比較活躍，在自然環境中極易生成活性表面積較大的氧化物。鐵錳氧化物以及鐵錳氫氧化物，具有較大的比表面和大量的—OH基團，參與土壤中多種離子的吸附與解吸過程，并表現出一定的氧化還原作用。除了對鈣、磷等離子具有較強的吸附作用外，對鎘、鉛、砷等重金屬（或類重金屬）元素以及有機物也具有一定的吸附作用[1-2]。含鐵礦物在酸堿度和氧化還原條件發生改變時易發生氧化或還原作用以及沉淀或溶解作用，決定著含鐵礦物中鐵和其他有關金屬元素在土壤中的存在形態、轉化特征和生物活性[3]，充當土壤重金屬元素的固定鈍化劑或改良劑，成為一種重金屬生物污染的地球化學屏障。

鐵是高等生物必需的微量營養元素，同時在特定條件下成為細菌的潛在能源物質[4]。微生物參與鐵氧化過程有主動與被動作用。前者通過酶反應將Fe（Ⅱ）氧化成Fe（Ⅲ），從而獲得能量;后者則作為結合和成核表面而促進氧化鐵在細胞壁和胞外聚合物上的沉淀。此外，由微生物代謝引起的pH值變化和某些細菌滲出物的產生也可能有利于鐵氧化物形成[5]。在對二十余種濕地植物進行調查時發現，根際有鐵細菌的存在概率達到92%[6]，其中，由微生物活動形成的鐵氧化物占到鐵氧化物總量的50%～90% [7-8]。微生物介導產生的鐵氧化物可以進一步催化鐵氧化過程。

錳的價態同樣較多，經常參與土壤中一系列的生物和地球化學過程，尤其是與鐵等其他金屬的氧化過程有著密切的聯系。錳氧化菌在海洋和陸地均有分布，它可以通過酶直接將錳氧化，也可以通過生理活動改變環境的pH值和氧化還原電位（Eh），促進錳的化學氧化[9]。微生物在錳的氧化過程中的作用要遠大于非生物氧化作用[10]，甚至常被認為是推動自然界中錳氧化物形成的主要貢獻者[11]。據報道，典型的錳氧化細菌為異養微生物，并不從錳氧化過程中獲取能量，介導錳氧化過程可能是為了減輕重金屬及紫外線脅迫等危害因子。

鐵錳氧化菌是指可以同時氧化鐵錳并從過程中獲得能量的微生物，這一過程伴隨著能量代謝及呼吸電子傳遞等。近些年來，由于對水體金屬污染處理的關注，不少學者對鐵錳氧化菌進行了相關研究[12-13]。蛋白胨酵母膏完全培養基（PYCM）因對錳氧化菌具有較強選擇性而常被用來篩選錳細菌[14]。在自然界中，鐵、錳氧化菌往往伴生存在，因此另加入檸檬酸鐵銨，可同時檢測細菌對鐵的氧化能力。

水稻是我國最重要的糧食作物，水稻產量占我國糧食總產量的40%以上。水稻長期生長在淹水環境，根系通氣組織發達，可以向根際土壤泌氧，造成土壤微域氧化還原電位差和鐵氧濃度梯度，從而為鐵氧化菌提供良好生境[15]，微生物介導形成的氧化鐵可吸附于植物根際周圍，形成鐵膜[2]。鐵膜的成分除了鐵氧化物外，還含有一定比例的錳氧化物，鐵膜對多種重金屬具有吸附作用[16]。如常見于稻田的周叢生物即為鐵錳氧化物、微生物以及微生物分泌的有機物和其他有機物所組成，在稻田重金屬固定方面具有積極意義[17]。鐵膜的存在不僅影響到水稻對污染元素的吸收與累積，也在一定程度上影響著營養元素的吸收與累積[18-20]，進而影響糧食的營養和安全問題，因此關于鐵膜的研究被廣泛關注[21]。

研究發現，細菌可能在調控水稻田鐵膜產生過程中起著關鍵作用，但目前對于水稻土鐵錳氧化菌的研究還有待深入。本試驗采用改良的纖毛菌培養基對富鐵水稻田土壤鐵錳氧化菌進行富集、純化，從系統分類學上對菌種進行鑒定，并對其形態學及氧化產物以及其對重金屬的吸附進行進一步分析，明確了其氧化鐵錳的效果，結果可為研究稻田重金屬污染治理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試稻田土壤樣品采自江蘇省鎮江市丹徒區榮炳鎮南莊村。土壤有機質含量范圍25%～35%，土壤pH值 6.0左右，耕作層生物可利用還原態鐵含量為2.0 mg/g（干土）。采集水稻分蘗期根際土壤用于培養鐵錳氧化細菌。

1.2 培養基準備

改良纖毛菌培養基（modified Leptothrix medium，簡稱培養基A）：2 g/L MnCO3·H2O2、0.3 g/L NH4Cl、1 g/L酵母提取物、1 mL/L微量元素（TES）溶液、1 mL/L維生素（Vit）溶液（ATCC配方）、2 mL/L 檸檬酸鐵溶液（將2.83 g硫酸亞鐵和3 g檸檬酸三鈉分別溶解后混勻，定容至20 mL，以 0.22 μm 無菌濾膜過濾后冷凍保存）、20 g/L瓊脂。

缺鐵的改良纖毛菌培養基（以下簡稱培養基B）的配方為A培養基去掉檸檬酸鐵溶液。缺錳的改良纖毛菌培養基（以下簡稱培養基C）的配方為培養基A去掉MnCO3·H2O。

1.3 菌種分離與篩選

將土壤樣品以等同于生理鹽水的礦物營養液在10-8～10-1進行梯度稀釋，并各取100 μL均勻涂布在A培養基上。在25? ℃條件下培養3 d后挑取單菌落轉接至新的平板上，經4～5次轉接，可得到單菌落。將分離得到的細菌接種到事先準備好的培養基A、B、C上，在25 ℃條件下培養1周，對其生長狀況進行觀察記載。采用亮柏蘭（LBB）染料對可能生成的錳氧化物進行檢測。

1.4菌種系統分類鑒定

挑選生長較好的菌落，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（生工，SK8255），按供應商步驟提取細菌DNA。采用通用細菌引物擴增16s rDNA，所用試劑盒為BigDye Terminator v1.1 試劑盒。引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）與1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）。通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產物生成情況，并進行純化回收（SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒SK8131）。純化的PCR產物用于Sanger測序，測序平臺為ABI測序儀（3730xl DNA Analyzer）。采用DNAMAN將測定序列拼接后，使用NCBI在線Blast數據庫進行比對（Blastn），比較所獲序列與已知核酸序列的同源性。下載近緣序列，并采用軟件系統進化數構建軟件MEGA（https：//www.megasoftware.net/）對序列進一步分析，并采用Neighbor joining方法建立菌種的系統發育樹。

1.5 掃描電鏡（SEM）與EDS能譜分析

將生長3 d左右的完好菌落從培養基上切取下來，參照掃描電鏡樣品處理常規方法先進行固定（2.5% 1，5-戊二醛電鏡專用固定液），洗滌后脫水（分別采用30%、50%、70%、80%、90%梯度濃度乙醇）、經過CO2臨界點干燥后，進行噴金處理。最終所得樣品采用環境掃描電子顯微鏡（PHILIPS，XL30ESEM）進行分析觀察。選取合適區域進行EDS能譜分析（加速電壓為0.5～20.0 keV，放大倍數為35 000倍）。上述測定于揚州大學理化測試中心進行。

1.6 菌株對鎘的耐性及吸附的影響

選取菌種MOB8，采用不加瓊脂的改良纖毛菌培養基C，分別加入終濃度為0、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/L 的Cd2+（CdCl2），接種后于25 ℃搖床（120 r/min）培養1周，觀察記錄菌種生長情況。最后添加最終濃度為5.0 mg/L的Cd2+，分別于1、3、5、7、9 d取樣，離心過濾，用原子吸收法測定溶液中Cd2+濃度，以評估菌株及其產物對鎘的吸附能力。

2 結果與分析

2.1 鐵錳氧化菌的篩選

在接種土壤稀釋濃度平板上選取12株有鐵銹色的菌落，采用劃線稀釋法轉接進行。在繼續培養時，發現有的菌落顏色加深，推測可能是由于所產生的色素積累所致，舍棄該類菌，繼續其他菌種的轉接與純化。最終獲得4株具有潛在鐵錳氧化功能的菌株，分別編號為MOB4、MOB8、MOB9和MOB11（圖1）。

幾株菌的菌落相對較小，生長速度慢，表面光滑黏稠，呈赭黃色或棕褐色，菌落中心顏色深且顏色不隨培養時間變化。在菌株生長過程中，發現有一些菌株的菌落四周產生赭色暈圈，如菌株MOB4與MOB11在3種培養基上均出現紅棕色暈圈。LBB染色鑒定也發現有氧化錳產物的生成。

相對而言，菌株MOB8在含鐵和錳的培養基（A）上生長得較快，而在缺錳的培養基（C）上所形成的菌落最大。在缺錳的C培養基上前4 d未見生長，1周后開始出現明顯菌落，后期逐漸增加。同樣，菌株MOB9在含鐵錳的培養基（A）上生長狀況最佳，培養的前4 d在C上也未見生長，8 d后開始出現菌落（圖1）。可見缺錳對這2株菌影響要大于缺鐵。

2.2 菌落掃描電鏡（SEM）與能譜分析結果

幾株菌的掃描電鏡結果（圖2）表明，其細胞形態均為球形至短桿形，大小為0.4～0.8 μm。在細胞表面包裹著大量的絮狀物和顆粒物，這可能是細胞生長所產生的胞外聚合物，以及一些鐵、錳的氧化產物。隨機選擇各株菌的電鏡樣品的一些區域進行X射線能譜分析，通過分析測定細胞表面的主要元素組成。從分析結果可以看出，除菌株MOB4外，各菌株表面均有一定量的鐵錳元素。菌株MOB8與MOB11的能譜圖中的Fe和Mn波峰要高于MOB9，表明所含鐵、錳相對較高。各菌株能譜測定結果中氧（O）的峰值也較高，結合平板培養與氧化物染色結果可以推測，這些菌株表面可能含有較大比例的鐵錳氧化物，其產物的具體結構與組成有待進一步分析。

2.3 菌株的16S rRNA基因序列分析

對菌株的16S rRNA 基因的測序分析，采用鄰接法所構建的系統進化樹（圖3）。菌株MOB4、MOB8、MOB9和MOB11在系統分類上比較接近，可以確定為同一屬。經過BLAST比對，其序列與不動桿菌Acinetobacter guillouiae相似度為99%，為近緣物種。可以將試驗篩選所得的4株菌鑒定為不動桿菌屬（Acinetobacter）。有關該菌氧化金屬鐵錳的報道尚未多見。

2.4 菌株對重金屬鎘吸附的影響

選取分離得到的鐵氧化菌MOB8進行液體培養試驗，發現其對鎘的耐受臨界濃度為0.75 mg/L，高于此濃度生長嚴重受影響。因此，選擇在培養基中加入最終濃度為5.0 mg/L的Cd2+，以檢測菌株及其產物對鎘的吸附能力。在培養的4～5 d，接種組瓶中變渾濁、開始出現鐵銹色的氧化物，空白組無明顯變化。培養9 d后，接種組樣品中的鎘含量下降了35.25%，空白組樣品中的鎘含量則下降了5.98%。鎘濃度的變化趨勢和菌株液體培養中Fe2+的濃度變化趨勢大致相同，表明氧化鐵的生成吸附了溶液中游離態的Cd2+。

3 討論與結論

自然界中鐵與錳元素的氧化在很大程度上取決于微生物活動，微生物氧化作用要遠高于非生物氧化過程[21-22]。微生物參與形成的鐵錳氧化物一般聚集于細胞表面，與胞外聚合物一起，形成較大的比表面[21]。因而，相對于化學氧化產物而言，生物鐵氧化物具有更高的吸附容量，對于環境中有害的重金屬離子及一些有機污染物有較大的吸附能力[23]。生物鐵錳氧化物對地球化學循環的貢獻已得到相關關注，來自不同環境的鐵錳氧化細菌也有報道[21]，而來自于水稻田的純菌種研究較少。水稻田以淹水條件為主，以微生物驅動鐵、錳氧化過程在水稻土中十分普遍，且常常居于主導地位[24]。鑒于當前我國稻田重金屬污染現狀嚴峻，鐵錳氧化菌在環境生態效應及生產上應用潛力巨大。

前人研究表明，改良纖毛菌培養基（modified Leptothrix medium）是一種選擇性培養基，適合用于鐵錳氧化菌的篩選。通過采用該方法所獲得的鐵錳氧化菌包括弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、節桿菌屬（Arthrobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）等[25-27]。本試驗通過選用改良纖毛菌培養基，成功培養出4株具有氧化鐵、錳功能的細菌MOB4、MOB8、MOB9、MOB11。根據16S rRNA 基因序列測定結果，結合菌種生長形態特征，將其鑒定為Acinetobacter sp.。Acinetobacter常見于土壤，為革蘭氏陰性菌，嚴格好氧，屬不動細菌屬。前人從活性污泥中分離得到該種菌[28]，發現其具有降解苯酚的特性。此外，該種菌被證明耐高鹽與耐重金屬離子，具有耐抗生素性[29]。但該類菌對于金屬鐵、錳的氧化能并尚未多見報道。根據鐵、錳氧化菌的生長特征與元素分析結果，可以初步判斷本試驗分離出的菌株對鐵和錳均具有一定的氧化能力，其產物的組成與結構特征需進一步研究。本試驗初步表明，該類細菌的生長有利于促進二價鐵的氧化，并提高對溶液中重金屬鎘的吸附。

綜上所述，本研究從富鐵的水稻田土壤中分離篩選得到 4 株具有鐵錳氧化功能的菌株，經過形態學及分子生物學鑒定為不動桿菌（Acinetobacter sp.）。菌株的生長可吸附并降低溶液中鎘的含量。

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