不同培養條件對栗仁菌核青霉菌生長的影響

霍佳歡 李雙民 溫曉蕾 馮麗娜 李雅麗 張娜娜 蘭淑慧 齊慧霞

摘要：菌核青霉菌（Penicillium sclerotiorum）是板栗儲藏期引起栗仁腐爛的主要致病菌之一。為明確該病菌生長及產孢的適宜環境條件，本試驗采用生長速率法和血球計數法對不同營養、溫度、pH值、通氣狀況等條件下病菌的生長情況進行了研究。結果表明，最適宜栗仁菌核青霉菌菌絲生長和產孢的溫度為25 ℃，pH值為6，光照條件為全黑暗;沙堡弱培養基最適合該病菌菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養基最適合產孢;菌核青霉菌在以木糖醇為基礎碳源的培養基上菌落直徑最大、產孢量最多;菌絲生長的最佳氮源為牛肉膏，產孢量最多的氮源為蛋白胨和酵母浸粉;菌絲體在24 h連續振蕩的條件下生長的最好;50 ℃為菌核青霉菌致死溫度。

關鍵詞：板栗;栗仁腐爛病;菌核青霉菌;培養條件

中圖分類號： S436.64? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0129-04

收稿日期：2021-03-25

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2020YFD1000700）;河北省教育廳平臺項目（河北省板栗產業協同創新中心，2019—2023年）。

作者簡介：霍佳歡（1997—），女，河北廊坊人，碩士研究生，研究方向為板栗病害流行與防控，E-mail：2469634717@qq.com;共同第一作者：李雙民（1968—），男，河北昌黎人，中學高級教師，研究方向為果樹病蟲害防治，E-mail：lishuangmin2021@163.com。

通信作者：溫曉蕾，碩士，實驗師，研究方向為分子植物病理學，E-mail：xiaoleiwen@sina.com;齊慧霞，碩士，教授，研究方向為植物病害流行與防控，E-mail：qihuix@163.com。

栗仁腐爛病是板栗生產上的常見病害之一，在南北方各板栗產區均有發生，近年來因板栗產量的大幅度提高，栗仁腐爛率也隨之增加，危害率高達40%～50%，嚴重制約著板栗產業的發展[1-2]。栗仁腐爛病常發生于貯藏期間，多由病原微生物引起，常見的有鐮刀菌屬、鏈格菌屬、單端孢屬、青霉屬以及曲霉屬等[3]，其中青霉屬在全國各板栗產區均可危害，造成栗仁發生青腐，產生褐色或青色的病斑，后期轉為藍綠色或青綠色[4]。目前板栗上已報道的青霉種類有小刺青霉、擴展青霉以及擬青霉等[5-7]，而對菌核青霉的研究相對較少。本試驗對引起貯藏期栗仁腐爛的菌核青霉菌其適宜培養條件進行研究，以期為制定有效的防腐保鮮措施提供科學依據，減少不必要的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2019—2020年在河北科技師范學院植物保護實驗室開展。栗仁菌核青霉菌（Penicillium sclerotiorum）由河北科技師范學院植物保護實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 在無菌超凈臺內，將直徑5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅分別接種到玉米粉、胡蘿卜、番茄、沙堡弱、燕麥馬鈴薯、綠豆、肉汁胨、板栗培養基平板中央，每種培養基各設3個重復，均于25 ℃全黑暗條件下培養。每間隔24 h采用十字交叉法[8]測量菌落直徑，菌落生長14 d時采用血球計數法測定孢子數量[9]。

1.2.2 溫度對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 超凈臺內將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于馬鈴薯葡萄球瓊脂（PDA）培養基中央，分別放置于5、10、15、20、25、30、35 ℃全黑暗培養箱中培養，每個溫度均設3次重復，菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節。

1.2.3 光照對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 超凈臺內將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于PDA平板中央，設置不同光照（24 h光照、12 h 光照/黑暗、24 h黑暗）條件，25 ℃下培養，每個處理重復3次。菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節。

1.2.4 不同pH值對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液調節PDA培養基的pH值，制成pH值為5、6、7、8、9、10、11的7種不同培養基，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于PDA平板中央，在25 ℃全黑暗條件下進行培養，每種pH值設3次重復，菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節。

1.2.5 碳源對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 將察氏培養基作為基礎培養基，分別用等量的肌醇、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖醇和乳糖替換察氏培養基中的蔗糖[10]，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于平板中央，每種碳源設3個重復，25 ℃全黑暗條件下培養。菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節。

1.2.6 氮源對菌核青霉菌菌絲生長和產孢的影響 基礎培養基同上，以等量的牛肉膏、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母浸粉和氯化銨替換察氏培養基中硝酸鈉[10]，將直徑為5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅接種于平板中央，每個處理重復3次，25 ℃黑暗下培養。菌落直徑和產孢量的測量方法同“1.2.1”節。

1.2.7 通氣狀況對菌絲生長的影響 將液體PDA培養基分裝到三角瓶中，每瓶100 mL，將3個直徑為0.5 mm的栗仁菌核青霉菌菌餅在超凈臺內接種到三角瓶內，在溫度為25 ℃，轉速為120 r/min搖床內分別24 h振蕩、12 h振蕩/12 h靜止、24 h靜止培養 5 d，每個處理設3次重復。5 d以后，將菌絲通過紗布過濾，用烘箱烘干（直到不含有任何水分），稱量菌絲干質量[11]。

1.2.8 致死溫度的測定 菌核青霉菌生長初期，未產孢之前（2 d以內）轉入裝有5 mL無菌水的試管中，每個處理標好編號，設置3個重復，將各試管按照不同編號依次放入40、45、50、55、60、65 ℃水浴鍋中，水浴10 min，然后將處理后的菌餅接種到PDA培養平板中央。25 ℃培養48 h后觀察菌絲生長情況，明確致死溫度。

2 結果與分析

2.1 培養基對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表1可知，栗仁菌核青霉菌在8種培養基上均可生長，最適合菌核青霉菌生長的培養基為沙堡弱培養基，14 d菌落直徑達7.95 cm;其次為板栗培養基，菌落直徑可達6.98 cm。適宜菌核青霉菌產孢的培養基為燕麥馬鈴薯培養基，培養14 d產孢量可達6.99×105個/皿。表明沙堡弱培養基最適合菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養基最適合產孢。

2.2 溫度對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表2可知，溫度對病原菌菌絲生長和產孢量均有顯著影響，栗仁菌核青霉菌在10～30 ℃條件下均能生長，最佳的生長溫度范圍在20～30 ℃，其中在25 ℃條件下菌落生長最好，14 d時菌落直徑可達到6.33 cm;同時25 ℃也最適合產孢，14 d時產孢量為3.76×105個/皿。溫度低于5 ℃或高于35 ℃時菌落生長十分緩慢，略有菌絲產生。

2.3 光照對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表3可知，在3種不同光照條件下，栗仁菌核青霉菌以全黑暗條件下生長最快，14 d時菌落直徑達6.8 cm。24 h光照和12 h光照/黑暗條件下菌落直徑相對較小，分別為6.02 cm和5.83 cm，且這2處理對菌核青霉菌菌絲生長的影響無顯著差異。全黑暗、全光照和12 h光照/黑暗3個處理對菌核青霉菌產孢量影響無顯著差異，14 d時產孢量分別為3.95×105、3.63×105、3.73×105個/皿。表明菌核青霉菌在黑暗條件下更易于菌絲生長和產孢。

2.4 不同pH值對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

栗仁菌核青霉菌在7種不同pH值上生長狀態如表4所示，最適宜栗仁菌核青霉菌菌絲生長和產孢的pH值為6，培養14 d菌落直徑達6.62 cm;產孢量為3.70×105個/皿。pH值為11時，菌落生長較慢，培養 14 d 菌落直徑為5.93 cm;pH值為5時，不適宜其產孢，培養14 d產孢量為2.35×105個/皿。

2.5 碳源對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表5可知，菌核青霉菌在8種不同碳源上均能生長，菌絲在以木糖醇為碳源的培養基上生長的最好，菌落直徑最大、產孢量最多，培養14 d菌落直徑為6.02 cm，產孢量為4.27×105個/皿;菌絲對可溶性淀粉的利用能力最低，培養14 d菌落直徑僅為3.45 cm。

2.6 氮源對菌核青霉菌菌絲生長、產孢的影響

由表6可知，栗仁菌核青霉菌在以牛肉膏、蛋白胨和硫酸銨為基礎氮源的培養基上生長的好，其中以牛肉膏的利用率最高，14 d時的菌落直徑為 7.68 cm;該病菌在以酵母浸粉和硝酸鈉為基礎氮源的培養基上菌落擴展相對較慢。供試氮源培養基中以蛋白胨和酵母浸粉的產孢數量大，14 d時產孢量分別為4.79×105、4.80×105個/皿，二者之間無顯著差異。

2.7 通氣狀況對菌核青霉菌生長的影響

由圖1可知，菌核青霉菌在不同通氣狀況下菌絲生長有較為顯著的差異，該病菌在24 h振蕩條件下菌絲生長的最好，培養5 d菌絲干質量可達 0.40 g;在24 h靜止和12 h振蕩/12 h靜止下該病菌菌絲生長相對較慢，5 d時菌絲干質量分別為0.21 g和0.16 g，由此可見菌核青霉菌在通氣良好的條件下更適宜生長。

2.8 致死溫度測定結果

將栗仁菌核青霉菌菌餅分別在40、45、50、55、60、65 ℃不同溫度的水浴鍋中處理10 min后，轉移到PDA平板中央25 ℃培養48 h，結果（圖2）表明，在40 ℃和45 ℃條件下處理的菌絲均可繼續生長，在50、55、60、65 ℃條件下處理過的菌絲則停止生長。因此可確定栗仁菌核青霉菌菌絲的致死溫度為50 ℃。

3 結論與討論

本試驗結合菌絲生長量和產孢量2個標準來衡量菌核青霉菌的適宜培養條件。研究發現，沙堡弱培養基最適合菌核青霉菌菌絲生長，燕麥馬鈴薯培養基最適合產孢;最適宜菌絲生長和產孢的溫度為25 ℃，pH值為6，光照條件為全黑暗;栗仁菌核青霉菌對木糖醇的利用率最高，在以木糖醇為基礎碳源的培養基上菌絲最適宜生長、產孢量最大;氮源中最適宜菌絲生長的為牛肉膏，但最適宜產孢的為酵母浸粉和蛋白胨;在24 h連續振蕩培養條件下最適合菌絲生長，培養5 d后菌落干質量達0.40 g。

郜海燕等指出，最適合擴展青霉生長的pH值為8，最適宜菌絲生長的碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母浸粉，這與菌核青霉略有不同[12]。王俊鳳等認為小刺青霉菌最適宜的生長溫度為20 ℃，pH值為7，最適宜菌絲生長和產孢的碳源分別為可溶性淀粉和甘露醇;同時適宜菌絲生長和產孢的氮源為酵母浸粉[5]。菌核青霉菌和小刺青霉菌雖同為青霉屬，且均為腐爛病的致病菌，但二者適宜生長條件具有一定差異，可能因病菌生長環境和種間差異所引起。丁仁惠等研究發現指狀青霉和意大利青霉的致死溫度分別為80 ℃和75 ℃，與菌核青霉的致死溫度50 ℃略有不同，此差異可能是因生長環境不同或因寄主不同所導致[13]。本研究明確了栗仁菌核青霉菌對環境和營養條件的需求，為有效預防和防治由菌核青霉菌引起的栗仁腐爛病提供理論支撐，具體防腐方法還需進一步研究探討。

參考文獻：

[1]梁麗松，王貴禧. 不同產區板栗病原菌的種類及其致病力研究[J]. 林業科學研究，2003，16（3）：284-288.

[2]王海霞，劉正坪，朱曉清，等. 板栗貯藏期致腐病原真菌種類鑒定及其侵染特性[J]. 北京農學院學報，2006，21（4）：33-36.

[3]吳光金，易潤華. 板栗致腐微生物種群鑒定[J]. 中南林學院學報，2000，20（4）：58-61.

[4]趙學平，貝亞維，王 強，等. 板栗貯藏期病害發生規律研究[J]. 植物保護，2000，26（4）：29-31.

[5]王俊鳳，溫曉蕾，孫偉明，等. 板栗腐爛病小刺青霉菌（Penicillium spinulosum）培養條件及藥劑篩選[J]. 中國農業科技導報，2020，22（3）：79-84.

[6]侯保林，張志銘，楊興民，等. 河北板栗種仁斑點類病害研究[J]. 河北農業大學學報，1988，11（2）：11-22.

[7]梁宗琦，韓燕峰，劉愛英，等. 擬青霉（Paecilomyces Bainier），一類應用前景廣闊的真菌資源[J]. 菌物系統，2003，22（增刊1）：17-23.

[8]曹星星.鐵皮石斛病原真菌分離與鑒定及印度梨形孢促生作用研究[D]. 杭州：浙江大學，2015.

[9]李愛華，岳思君，馬海濱. 真菌孢子三種計數方法相關性的探討[J]. 微生物學雜志，2006，26（2）：107-110.

[10]楊成前，吳中寶，余中蓮，等. 重慶市白術根腐病發生危害及其病原菌生物學特性[J]. 南方農業學報，2018，49（8）：1561-1567.

[11]姜小玉，臺蓮梅，劉鳳艷，等. 水稻谷粒褐變致病菌禾谷鐮孢菌絲生長特性研究[J]. 安徽農學通報，2015，21（18）：70-72.

[12]郜海燕，肖尚月，陳杭君，等. 藍莓采后主要病原真菌的分離鑒定與生物學特性研究[J]. 農業機械學報，2017，48（5）：327-334.

[13]丁仁惠，何小娥，王文龍，等. 柑橘采后主要病原菌的生物學特性研究[J]. 湖南農業科學，2018（12）：76-81.