孕穗期剪葉對稻田甲烷排放的影響

王瀾 趙步洪 張亞軍 蔣紅亮 李國明 劉立軍 陳云

摘要：水稻根系對稻田甲烷排放有重要影響，剪葉可以調(diào)節(jié)水稻源庫關(guān)系和根冠生長，但其對稻田甲烷排放的調(diào)控效應(yīng)及機(jī)制尚不清楚。以揚(yáng)稻6號（秈稻）和日本晴（粳稻）為材料，在大田栽培條件下對孕穗期水稻植株進(jìn)行剪葉處理，研究植株與土壤的相關(guān)性狀及其對稻田甲烷排放的影響。結(jié)果表明，與對照相比（未剪葉），剪葉處理顯著降低了稻田甲烷排放通量，揚(yáng)稻6號和日本晴2個品種的甲烷排放通量在剪葉36 h后分別比對照降低了23.0%和22.1%。剪葉極顯著降低了水稻葉面積指數(shù)，但其對根系形態(tài)特征、根系泌氧能力和氧化力無顯著影響;剪葉處理使根中非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（NSC）和根系分泌物總有機(jī)碳（TOC）含量顯著降低，但使2個品種根中NSC/TOC分別增加了33.1%和28.9%。Mantel檢驗(yàn)分析表明，根中NSC/TOC是影響稻田甲烷通量和產(chǎn)甲烷菌最主要的因素。這些結(jié)果表明，剪葉處理可以調(diào)節(jié)光合產(chǎn)物在根系和根際土壤中的分配，提高NSC/TOC，導(dǎo)致土壤中產(chǎn)甲烷菌數(shù)量下降進(jìn)而減少稻田甲烷排放。

關(guān)鍵詞：水稻;剪葉;甲烷排放;根系;非結(jié)構(gòu)性碳水化合物;NSC/TOC

中圖分類號： S511.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0071-06

收稿日期：2021-06-15

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（17）3042];江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20181214）;國家自然科學(xué)基金（編號：31871557、32071947）。

作者簡介：王 瀾（2001—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，主要從事水稻生理生態(tài)研究。E-mail：3465393772@qq.com。

通信作者：陳 云，博士，副教授，主要從事水稻生理生態(tài)研究。E-mail：yunchen@yzu.edu.cn。

全球氣候變暖一直備受關(guān)注。甲烷（CH4）是第二大溫室氣體，增溫潛勢約為二氧化碳（CO2）的28倍，其溫室效應(yīng)僅次于CO2[1]。水稻是全球最重要的糧食作物之一。然而，稻田也是甲烷的重要排放源，約20%的人為甲烷排放來自稻田[2]。因此，控制稻田甲烷排放對緩解全球溫室效應(yīng)具有重要作用。

水稻的植株脫落物、根系分泌物以及土壤中的有機(jī)質(zhì)等可以為土壤中的產(chǎn)甲烷菌提供甲烷產(chǎn)生的底物[3-4]。葉片光合作用固定的碳是水稻植株生物碳積累及籽粒充實(shí)的最主要來源。剪葉或疏花處理可以調(diào)節(jié)水稻的源庫關(guān)系，影響植株的干物質(zhì)積累及光合同化物向根系的轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。有研究表明，在苗期或孕穗期剪葉后水稻的根質(zhì)量及根系活力都有所增加[6]。雖然水稻葉片的光合作用產(chǎn)物不直接作為甲烷產(chǎn)生的底物，但植物-土壤系統(tǒng)中光合碳的分配與周轉(zhuǎn)非常迅速，使用同位素標(biāo)記的方法發(fā)現(xiàn)光合作用固定的碳在幾小時內(nèi)即可分配到根際土壤，進(jìn)而在稻田排放的甲烷中檢測到標(biāo)記的甲烷[7-8]。孕穗期是稻田甲烷排放的高峰期之一，此期甲烷排放量可占全生育期總甲烷排放的40%以上[9]。但孕穗期光合產(chǎn)物在根系中的分配及其與土壤性狀的關(guān)系的研究較少，生理機(jī)制也尚不明確。

本研究選用秈稻揚(yáng)稻6號和粳稻日本晴為材料，通過在孕穗期剪葉處理減少水稻葉片光合源，研究剪葉對光合同化碳在根系和土壤中分配的影響及其對土壤中甲烷相關(guān)菌群的調(diào)節(jié)。旨在進(jìn)一步揭示水稻植株對稻田甲烷排放的影響機(jī)制，為稻田甲烷減排提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年和2020年在揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)農(nóng)場（119°25′E、32°30′N）進(jìn)行。供試品種為揚(yáng)稻6號（YD 6）和日本晴（NIP）。試驗(yàn)田前茬作物為小麥，土壤為沙壤土，有機(jī)質(zhì)含量為23.0～25.8 g/kg，速效鉀含量為60.8～65.4 mg/kg，有效氮含量為111～123 mg/kg，速效磷含量為30.2～34.3 mg/kg。水稻播種期為5月15日，移栽期為6月10日，收獲期為10月8—12日。株行距分別為0.16、0.25 m，單本種植。全生育期施用氮肥（折合純氮）270 kg/hm2，其中基肥占60%，分蘗肥占10%，穗肥占30%。每小區(qū)在移栽前一次性基施過磷酸鈣（含P2O5 13.5%） 300 kg/hm2 和氯化鉀（含K2O 52%）195 kg/hm2。整個水稻生育期按照常規(guī)灌溉進(jìn)行水分管理，中期擱田1周。定期除草、施用農(nóng)藥并嚴(yán)格控制雜草和病蟲害。

水稻生長至孕穗期時，將每株水稻莖蘗上倒1葉至倒3葉共3張葉片沿葉脈縱向剪去1/2（leaf-cutting），以不剪葉為對照（control）。每個處理各 15 m2，3次重復(fù)。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 稻田甲烷的收集與分析 使用靜態(tài)箱-氣相色譜法采集并測定稻田排放的甲烷。剪葉處理后的48 h內(nèi)，每隔12 h取氣1次。采集的氣體用氣相色譜儀分析甲烷濃度。甲烷通量計(jì)算公式參照Chen等的方法[9]，具體如下：

F=MV1×PP1×T1T×H×dCdt。

式中：F為氣體排放通量;M為氣體摩爾質(zhì)量;V1、P1和T1分別為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下氣體的摩爾體積、空氣壓強(qiáng)及絕對溫度;P和T分別為采樣點(diǎn)的空氣氣壓和絕對溫度;H為箱體的高度;dCdt為單位時間內(nèi)箱子內(nèi)甲烷濃度變化率。

1.2.2 植株取樣與測定 剪葉處理36 h時，每小區(qū)選取有代表性的植株3株，用便攜式葉面積儀測定葉面積指數(shù)，用葉綠素儀測量劍葉葉綠素的相對含量（SPAD值）。用便攜式光合儀測量光合指標(biāo)。在對上述性狀進(jìn)行測量的同一天，每個小區(qū)采集12株水稻，取樣時盡量減少邊際效應(yīng)。將其中3株用于根系性狀測定，并測定根中非結(jié)構(gòu)碳水化合物（nonstructural carbohydrates，NSC）含量，3株用于根系氧化活力測定，3株用于根系泌氧能力測定，剩余3株用于收集和分析根分泌物。

1.2.3 根中NSC含量測定含量 參照Wang等的方法[10]提取并測定根中可溶性糖和淀粉含量。NSC濃度是指可溶性糖和淀粉的含量之和。每株水稻根中NSC含量以根生物量與單位質(zhì)量根中NSC含量的乘積表示。

1.2.4 根系性狀 用液壓氣動沖洗裝置將根洗凈，并從根基部分離。用掃描儀掃描完根系圖像后，用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)（Regent Instruments Inc.，Canada）分析，計(jì)算單株根數(shù)、根長、根直徑和根表面積[9]。之后將根系放入烘箱中在105 ℃下烘 30 min，然后在75 ℃下烘干至質(zhì)量恒定，測定根干質(zhì)量。用α-萘胺法測定根系氧化活力[11]，用檸檬酸比色法測定根系泌氧能力[12]。

1.2.5 根系分泌物的收集和分析 根系分泌物的收集和稻田取氣同時進(jìn)行，按照Chen等的描述[9]進(jìn)行，使用總有機(jī)碳分析儀分析樣品中的有機(jī)碳含量。

1.2.6 土壤樣品采集與分析 使用直徑為3 cm的土壤采樣器從水稻根系中心2～10 cm深處收集新鮮土壤。樣本用于實(shí)時熒光定量PCR測定土壤甲烷相關(guān)菌群數(shù)量。以提取的土壤DNA為模板，使用ABI 7500定量分析土壤產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的數(shù)量。PCR反應(yīng)體系包括5 μL qPCR Master Mix、0.5 μL primer mix和4.5 μL模板。擴(kuò)增條件為 95 ℃ 預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)10 s;最后72 ℃延伸 1 min。引物[9]為產(chǎn)甲烷菌（mcrA）：MLF（GGTATGGAGCAGTACGAGGAGTTC）和MLR（GTAGCCGAAGAAGCCGAGACG），甲烷氧化菌（pmoA）：A189F（GGTGACTGGGACTTCTGG）和MB661R（CCGTGCAACGTCYTTACC）。以1 g干質(zhì)量土壤中的基因拷貝數(shù)表示土壤菌群的數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 18.0 用于獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)分析。R語言中的ggplot2程序包用于繪制折線圖和箱形圖，fmsb程序包用于繪制雷達(dá)圖，ggcor程序包用于Mantel test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)植物性狀變量矩陣與甲烷排放通量之間的相關(guān)性。

試驗(yàn)重復(fù)2年，除箱形圖呈現(xiàn)所有數(shù)據(jù)點(diǎn)外，其余均以2年數(shù)據(jù)的平均結(jié)果表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 剪葉處理對稻田甲烷排放通量的影響

由圖1可知，剪葉處理顯著降低了YD 6和NIP的稻田甲烷排放通量。2個品種的稻田甲烷排放通量在剪葉處理后逐漸降低。與對照不剪葉相比，剪葉后36 h差異均達(dá)極顯著水平。此時，YD 6 和NIP分別比對照組極顯著降低了23.0%和22.1%。36 h 之后甲烷排放通量趨于平穩(wěn)。

2.2 剪葉處理對水稻葉片光合指標(biāo)的影響

由圖2可知，YD 6 的葉面積指數(shù)（LAI）和NIP差異不顯著。與對照相比，剪葉處理使2個品種的LAI分別下降了11.0%和6.0%。剪葉處理對葉片SPAD值和凈光合速率（Pn）的影響一致，二者均呈現(xiàn)增加趨勢，t檢驗(yàn)表明僅有NIP的Pn變化呈顯著水平。雙因素分析結(jié)果表明，SPAD值和Pn在品種和處理間均有差異，但上述光合指標(biāo)在品種和處理之間無互作效應(yīng)（表1）。

2.3 剪葉處理對水稻根系形態(tài)生理的影響

由圖3可知，處理36 h后，與對照相比，剪葉處理對YD 6 和NIP 的主要根系形態(tài)指標(biāo)（根長、根質(zhì)量、根直徑等）均無顯著影響。根系氧化力及根系泌氧能力的變化也未達(dá)顯著水平。表明剪葉處理后36 h并不影響水稻根系的主要形態(tài)特征，對根系活力的影響也較小。

根系非結(jié)構(gòu)性碳水化合物及根系分泌物中總有機(jī)碳（TOC）含量測定結(jié)果表明，與對照相比，剪葉處理后YD 6和NIP根中NSC含量分別降低了19.6% 和 25.6%， TOC含量分別降低了40.1% 和42.2%（圖3）。2個品種NSC/TOC的比值則分別增加了33.1%和28.9%，且與對照相比差異達(dá)極顯著水平（圖4）。

2.4 剪葉處理對甲烷相關(guān)菌群數(shù)量的影響

如圖5所示，剪葉處理后YD 6 和NIP根際土壤中產(chǎn)甲烷菌數(shù)量均極顯著下降，分別下降31.6%和43.2%;而甲烷氧化菌數(shù)量無顯著變化。

甲烷通量與甲烷相關(guān)菌群的相關(guān)性分析結(jié)果表明，剪葉處理下甲烷通量與產(chǎn)甲烷菌顯著相關(guān)，與甲烷氧化菌相關(guān)性不顯著（圖6）。

2.5 植株性狀與甲烷通量和產(chǎn)甲烷菌的Mantel檢驗(yàn)分析

通過Mantel 檢驗(yàn)分析甲烷排放通量和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量與水稻植株性狀的相關(guān)關(guān)系。由圖7可以看出，在所觀測的水稻植株的10個性狀中，根系中NSC/TOC比值是影響甲烷通量和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的主要因素。NSC和TOC為影響甲烷通量和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的次要因素。其他植株性狀與甲烷排放通量和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量均無顯著相關(guān)性。表明水稻根系NSC/TOC的比值可以調(diào)控產(chǎn)甲烷菌數(shù)量，從而影響稻田甲烷排放。

3 討論與結(jié)論

3.1 剪葉對稻田甲烷排放的影響

前人通過同位素標(biāo)記等手段研究發(fā)現(xiàn)稻田產(chǎn)甲烷菌所需碳源的60%來自以根分泌形式分配到根際的光合碳，其余部分來自水稻植株脫落物以及沉積有機(jī)物的降解[3，8]。剪葉處理會降低植株的總光合產(chǎn)物量[13]。也有報道認(rèn)為，減源處理使水稻劍葉的SPAD值和光合速率增加，表現(xiàn)為反饋促進(jìn)效應(yīng)[14]。通過人工剪穗和轉(zhuǎn)基因的方式減少或增加光合產(chǎn)物向穗部運(yùn)輸，可改變根系分泌的光合產(chǎn)物量從而增加或減少稻田甲烷排放[4，15-16]。本研究觀察到剪葉雖然增加了水稻單葉的SPAD值和凈光合能力，但由于LAI的極顯著降低，根系分泌物中有機(jī)碳含量也顯著降低，土壤中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量降低，最終導(dǎo)致甲烷排放減少。

吳降星等研究表明，剪葉面積為30%～50%時，剪葉處理后水稻根系干物質(zhì)量和活力顯著增加[6]。一定程度的剪葉率激發(fā)的根系活力增加對于延長植株葉片后期功能、延緩葉片葉綠素的降解、維持較大的光合作用面積、延長葉片壽命和功能期及增加灌漿物質(zhì)的制造均有積極的作用[17-18]。本研究中剪葉處理未顯著影響根系形態(tài)和生理指標(biāo)，這可能與本研究處理時間較短（0～48 h）有關(guān)。

3.2 剪葉影響稻田甲烷排放的原因分析

在稻田甲烷的循環(huán)系統(tǒng)中，水稻植株、產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌是決定稻田甲烷釋放量的關(guān)鍵因素，而根際甲烷相關(guān)菌群又與水稻植株所營造的生境密切相關(guān)[9]。前人研究表明，水稻的地上部性狀如分蘗數(shù)、株高等，地下部性狀如根活力對稻田甲烷排放的影響不盡相同[19]。剪葉處理后會增大分配到根系的光合產(chǎn)物的利用比例，從而對根系生長和根系活力進(jìn)行生理補(bǔ)償[6]。NSC是光合碳分配的主要形式，根系NSC含量表明光合生產(chǎn)在根系生長和根系呼吸損失之間的平衡，而TOC含量則表現(xiàn)為根沉積能力[20-21]。在本試驗(yàn)條件下，剪葉處理同時降低了NSC和TOC含量，但極顯著增加了NSC/TOC。Mental檢驗(yàn)分析表明，剪葉處理甲烷排放的變化主要是源于產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的變化而非甲烷氧化菌的變化，并且水稻根系特征NSC/TOC是驅(qū)動甲烷排放差異的主要因素。

綜上所述，剪葉后減少了水稻光合產(chǎn)物向根際土壤的分泌，降低了土壤中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量，導(dǎo)致甲烷排放減少。水稻根系NSC/TOC是影響稻田產(chǎn)甲烷菌和甲烷排放通量的重要因素。該研究為深入理解稻田甲烷排放機(jī)制提供了新思路，為通過調(diào)節(jié)水稻植株生長實(shí)現(xiàn)甲烷減排提供了途徑。

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