杜鵑紅山茶愈傷組織誘導條件的優化

李先民 卜朝陽 李春牛 崔學強 黃莉萍 盧家仕 黃展文 蘇群

摘要：為明確不同處理對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導的影響，以8年生杜鵑紅山茶為材料，研究不同外植體材料、滅菌方式、培養基種類、激素種類及配比、活性炭濃度等對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導的影響。結果表明：（1）在相同的滅菌方式下，葉片外植體愈傷誘導率均明顯高于葉柄外植體和花瓣外植體。采用0.1% HgCl2滅菌5 min，葉片外植體愈傷誘導率最高，達48.89%。（2）MS培養基是最適合葉片和花瓣外植體愈傷組織誘導的基本培養基，葉片和花瓣在該培養基中的愈傷誘導率均最高，分別達42.12%、37.62%。（3）培養基中添加不同濃度的6-BA與GA3對葉片外植體愈傷誘導率具有顯著影響，低濃度的6-BA和高濃度的GA3有利于提高愈傷誘導率，愈傷誘導率最高的激素組合為1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3，誘導率達61.67。（4）外植體褐化率隨添加活性炭濃度的增加呈逐漸降低的趨勢，添加活性炭濃度為1.2 g/L時，葉片和花瓣外植體褐化率最低且愈傷誘導率處于最高水平。

關鍵詞：杜鵑紅山茶;愈傷組織誘導;外植體;滅菌;培養基;激素

中圖分類號：S685.140.4+3? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0061-05

收稿日期：2021-06-22

基金項目：廣西科技基地和人才專項（編號：桂科AD18281004）;廣西農業科學院基本科研業務專項（編號：桂農科2017YM47）;廣西農業科學院科技先鋒隊專項（編號：桂農科JZ2020013）;廣西農業科學院科技發展基金（編號：桂農科2021JM29）。

作者簡介：李先民（1988—），男，廣西南寧人，碩士，助理研究員，主要從事觀賞植物栽培與育種研究。E-mail：lixm7406@126.com。

通信作者：李春牛，碩士，副研究員，主要從事觀賞植物選育及栽培研究。E-mail：lichunniu@126.com。

杜鵑紅山茶（Camellia azalea）為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）常綠灌木或小喬木，是中國特有珍稀瀕危物種，現存野生植株僅1 000多株，僅在廣東省陽春市鵝凰嶂省級自然保護區內一個狹窄的河谷兩旁有零星分布[1]，已被《中國物種紅色名錄》列為極危種[2]。杜鵑紅山茶花期長，夏、秋2季為盛花期，在適宜的栽培條件下一年四季都可以開花，是迄今為止發現的唯一能真正全年開花的山茶物種，彌補了山茶屬夏季和秋季不開花的空白[3]。杜鵑紅山茶開花稠密、花朵大而艷紅，葉形奇特、葉厚革質，植株緊湊，病蟲害少，適應性強，在園林與觀賞園藝方面具有廣闊的應用前景[4];同時，杜鵑紅山茶是培育雜交四季茶花優良品種的寶貴親本材料，具有極高的科研價值[5]。

近年來，隨著杜鵑紅山茶知名度及市場需求與日俱增，國內外關于杜鵑紅山茶繁殖技術的研究也逐漸增多，主要集中在扦插繁殖[6]、嫁接繁殖[7]、播種育苗[8]方面，有關組織培養的研究較少。利用組織培養，可以生產大量的優良無性系[9]，將植物組織培養技術應用于杜鵑紅山茶的快速繁殖，對種質資源保護，豐富園林植物多樣性，緩解杜鵑紅山茶苗木供應緊張的狀況，為科研提供優良無性系，皆具有十分重要的意義。本研究以杜鵑紅山茶葉片、葉柄及花瓣作為外植體，研究不同外植體材料、滅菌方式、培養基種類、激素種類及配比、活性炭濃度等對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導的影響，探索提高杜鵑紅山茶愈傷組織誘導效果的技術方法，旨在為杜鵑紅山茶組織培養提供理論依據，以期為其他同類型林木組織培養技術的研究提供經驗和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于廣西農業科學院花卉研究所組培中心。組織培養室培養溫度為（25±2） ℃，光照度為3 000 lx，光照時長為12 h/d。

1.2 試驗材料

試驗材料采自廣西農業科學院花卉研發與推廣中心山茶資源圃生長健壯的8～9年生杜鵑紅山茶植株，以成熟葉片、成熟葉片的葉柄、花瓣（選擇花苞，剝去外部受損花瓣，采用由外至內第3～4層花瓣）3種材料作為外植體。在碟子上將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的塊狀，葉柄剪成約0.5 cm的小段，將花瓣剪成0.5 cm×0.5 cm的塊狀。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同外植體及滅菌方式 試驗于2020年6月進行，以葉片、葉柄、花瓣作為外植體材料，先用75%乙醇棉球擦洗外植體表面，飽和洗衣粉水洗滌，再用流水沖洗15～20 min，在超凈工作臺上用75%的乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次后，進行滅菌處理，滅菌劑采用0.1% HgCl2（氯化汞）或10% NaClO（次氯酸鈉），0.1% HgCl2設置5、7、10 min 3個滅菌時間，10% NaClO設置10、15、20 min 3個滅菌時間，共6個滅菌處理，滅菌處理后用無菌水清洗5～6次。處理完成接種于MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）培養基中，各處理接種15瓶，每瓶3個外植體，重復3次。培養50 d后統計外植體愈傷誘導率及污染率。

1.3.2 不同外植體及培養基 試驗于2020年6月進行，以葉片、花瓣作為外植體材料，先用75%乙醇棉球擦洗表面，飽和洗衣粉水洗滌，再用流水沖洗15～20 min，在超凈工作臺上用75%的乙醇浸泡 30 s ，無菌水沖洗3次后，轉入0.1% HgCl2中浸泡5 min，無菌水沖洗5～6次。在碟子上將葉柄剪成約0.5 cm的小段，葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的塊狀，花瓣除去最外層后，將花瓣剪成0.5 cm×0.5 cm 的塊狀，分別接入MS培養基（青島海博）、B5培養基（青島海博）、WPM培養基（青島海博）及SH培養基（北京酷來搏）中，每種培養基均添加 1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。各處理接種15瓶，每瓶3個外植體，重復3次。培養50 d后統計外植體愈傷誘導率及褐化率。

1.3.3 不同激素處理 試驗于2020年6月進行，以葉片作為外植體材料，按“1.3.2”節的方法滅菌，誘導培養基以MS為基本成分，添加3%蔗糖、0.4%瓊脂，同時添加不同種類和濃度的激素，采用 L9（34） 正交設計方案（表1），設置6-BA濃度、NAA濃度及GA3濃度等3個因素，每個因素分別設3個水平，共9個激素組合處理，pH值5.8。各激素組合接種10瓶，每瓶2個外植體，重復3次。培養50 d后統計外植體愈傷誘導率。

1.3.4 活性炭防褐化試驗 試驗于2020年6月進行，以葉片、葉柄、花瓣作為外植體材料，按“1.3.2”節的方法滅菌，接入不同濃度處理的培養基中。培養基為MS+6-BA（1.0 mg/L）+ NAA（1.0 mg/L）誘導培養基，培養基中添加活性炭濃度設置4個水平，即0、0.4、0.6、1.2 g/L。每種處理接種15瓶，每瓶3個外植體，重復3次。培養50 d后統計愈傷誘導率和褐化率。

1.4 統計分析

采用Excel 2010軟件進行數據統計，采用SPSS 21.0 軟件進行方差分析和顯著性檢驗（Duncans新復極差法）。

2 結果與分析

2.1 不同外植體及滅菌方式對愈傷組織誘導的影響

不同外植體及滅菌方式對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導率及污染率的影響見表2，不同處理間杜鵑紅山茶外植體愈傷誘導率及褐化率的差異均達到了顯著水平。選擇葉片作為外植體，采用0.1% HgCl2滅菌5 min，外植體誘導愈傷誘導率最高，達48.89%，與選擇葉片作為外植體的其他處理以及T13、T14、T16相比差異不顯著（P>0.05），但顯著高于其他處理。選擇葉片作為外植體，在相同的滅菌方式下，其愈傷誘導率均明顯高于采用葉柄和花瓣作為外植體。選擇葉柄作為外植體，采用10% NaClO滅菌10 min，外植體褐化率最高，達61.90%，與選擇葉柄作為外植體的其他處理以及T4相比差異不顯著（P>0.05），但顯著高于其他處理。選擇葉柄作為外植體，在相同的滅菌方式下，其褐化率均明顯高于采用葉片和花瓣作為外植體。

2.2 不同外植體及培養基對愈傷組織誘導的影響

不同外植體及培養基對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導率及褐化率的影響見表3，不同處理間杜鵑紅山茶外植體愈傷誘導率及褐化率的差異均達到了顯著水平（P<0.05）。各處理中，選擇葉片作為外植體，接種于MS培養基上，愈傷誘導率最高，達4212%，愈傷誘導率顯著高于接種于其他培養基上的葉片，但與花瓣接種于MS、B5及SH培養基相比差異不顯著。選擇葉片作為外植體，接種于B5培養基上，外植體褐化率最高，達68.75%，顯著高于其他處理，其他處理間褐化率差異不顯著，褐化率最低的處理為T3，即選擇葉片作為外植體，接種于WPM培養基上，褐化率為31.67%。

2.3 不同激素處理對愈傷組織誘導的影響

從表4可以看出，愈傷誘導率最高的處理為激素組合3，即1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3，發芽率達61.67%，與組合5相比愈傷誘導率差異不顯著，顯著高于其他處理組合（P<0.05）。

方差分析（表5）表明，6-BA濃度與GA3濃度對杜鵑紅山茶葉片愈傷誘導率的影響達到顯著水平（P<0.05）。從圖1可以看出，隨著6-BA濃度的增加，愈傷誘導率呈逐漸降低的趨勢;隨著GA3濃度的增加，愈傷誘導率呈逐漸升高的趨勢。NAA濃度對杜鵑紅山茶愈傷誘導率的影響不顯著（P>0.05），但較高濃度的NAA可提高葉片愈傷誘導率。極差分析結果表明，本試驗設置的3個因素對發芽率的影響由大到小排列為GA3濃度>6-BA濃度>IAA濃度，就愈傷誘導率而言A1B3C3組合為最佳組合，即采用添加了1 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+0.6 mg/L GA3的MS培養基誘導愈傷組織效果最佳，該組合與實際觀測的最優組合（處理組合3）一致。

2.4 活性炭對愈傷組織誘導及防褐化的影響

不同活性炭濃度對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導率及褐化率的影響見表6，不同處理間杜鵑紅山茶外植體愈傷誘導率及褐化率的差異不顯著。選擇葉片作為外植體，添加活性炭濃度為1.2 g/L時，愈傷誘導率最高且褐化率最低，分別為40.39%、2056%，但愈傷誘導率和褐化率與其他處理相比差異不顯著。選擇葉片或花瓣作為外植體，隨著添加活性炭濃度的增加，外植體褐化率均呈逐漸降低的趨勢。

3 討論與結論

外植體類型會影響愈傷的誘導[10]，同種植物不同部位的組織，其再生能力存在較大差別，因此對外植體的篩選也是組織培養中的關鍵技術。本試驗中，選擇杜鵑紅山茶葉片和花瓣作為外植體，在相同的滅菌方式下，其愈傷誘導率均高于葉柄，褐化率均低于葉柄，這可能是由于葉柄基部抱莖，夾帶有較多雜菌，且外形不規整，不易被消毒清洗徹底，結合實際觀察，葉柄作為外植體接種后褐化率較高，導致其難以形成愈傷組織。同時，考慮組織培養生產的無菌葉片數量上要多于葉柄及花瓣，因此，葉片更適合作為外植體加以使用。本試驗中，隨著滅菌劑滅菌時間的延長，葉片及花瓣的愈傷誘導率及褐化率均逐漸降低，這可能是因為消毒時間適當延長可以降低污染，但是會傷害到外植體組織，導致外植體死亡率升高[11]。結合實際觀察，選擇葉片作為外植體，采用0.1% HgCl2滅菌5 min，出現愈傷組織時間較快，最有利于愈傷組織誘導。

本研究表明，培養基的種類對愈傷組織的誘導率及愈傷組織的質量存在顯著影響，這與不同培養基的組成差異較大，對杜鵑紅山茶外植體細胞的生長產生了不同的影響有關[12]。本試驗中，葉片外植體接種于MS培養基的愈傷誘導率最高，葉片及花瓣外植體接種于MS培養基的愈傷誘導率均高于接種于其他3種培養基。結合實際觀察，就葉片而言，接種于MS培養基較其他培養基形成愈傷組織快，數量多，質地均勻致密，為黃綠色，愈傷組織質量較好，生長能力更強，更接近與胚性愈傷組織，說明MS培養基能充分提供杜鵑紅山茶愈傷組織誘導及生長所需養分，是最適合杜鵑紅山茶愈傷組織誘導的基本培養基。

植物激素是植物愈傷組織誘導分化的關鍵性因素[13]，外源激素起著傳遞遺傳物質的脫分化、再分化等發育信號的作用[14]，激素種類及濃度是影響胚性愈傷組織誘導的關鍵因子之一[15-16]，本試驗選擇的3種激素中，6-BA濃度與GA3濃度對杜鵑紅山茶葉片愈傷誘導率影響顯著，NAA濃度對杜鵑紅山茶愈傷誘導率的影響不顯著;隨著6-BA濃度的增加，愈傷誘導率呈逐漸降低的趨勢，隨著GA3濃度的增加，愈傷誘導率呈逐漸升高的趨勢。可以認為杜鵑紅山茶外植體在誘導愈傷組織階段對6-BA濃度與GA3濃度反應敏感，外植體要求較低的6-BA濃度水平及較高的GA3濃度水平。試驗通過多重比較得出理論上最佳組合為A1B3C3，與實際觀測的最優組合一致，在今后的試驗中可以以這一組合為參考，在此基礎上進一步調整細化6-BA及GA3的配比，以達到更為理想的愈傷組織誘導效果。

山茶科植物中酚類物質含量較高[17]，當酚類化合物含量高時，木質素、單寧或色素形成就多，酚類物質易經氧化形成醌類物質，導致褐變的發生[18]，褐化現象是制約愈傷組織生長、增殖和分化的主要因素[19]。在培養基中添加適宜濃度的防褐化劑可有效地抑制褐化[20]。本試驗中，隨著添加活性炭濃度的增加，外植體褐化率呈逐漸降低的趨勢，與呂宗友等的研究結果[21-22]一致，說明在培養基中添加適宜濃度活性炭對外植體褐化有較好的控制效果，且能有效提高愈傷誘導率，這可能是采用活性炭等酚類吸收劑從根源上阻斷了褐化這一系列化學反應，本試驗中添加活性炭濃度為1.2 g/L時，葉片和花瓣外植體褐化率最低且愈傷誘導率處于最高水平，是最為適合的活性炭添加濃度。

杜鵑紅山茶愈傷組織誘導宜選擇葉片作為外植體。就葉片外植體而言，采用0.1% HgCl2滅菌 5 min 滅菌效果最佳;接種于MS培養基上形成愈傷組織快，愈傷組織質量好;在MS培養基中添加低濃度的6-BA及高濃度的GA3有利于提高愈傷誘導率，添加1.2 g/L活性炭，能有效防止外植體褐化。

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