基于科研創(chuàng)新能力培養(yǎng)的綜合型拓展實(shí)驗(yàn)研究與實(shí)踐

卻志群　沈春修　王舸泓　李麗娜

摘要：為了培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣和創(chuàng)新能力，使學(xué)生了解學(xué)科前沿，掌握新技術(shù)和新方法，縮小理論與實(shí)踐距離，結(jié)合教師科研部分成果設(shè)計(jì)了金色穎殼水稻種質(zhì)資源創(chuàng)制研究綜合型拓展實(shí)驗(yàn)，包括選題的背景、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、教學(xué)實(shí)施及教學(xué)效果等。實(shí)踐結(jié)果表明，選題結(jié)合實(shí)際，學(xué)生參與感強(qiáng)，在完成綜合型實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生文獻(xiàn)查閱能力、動(dòng)手實(shí)操能力、科研興趣和創(chuàng)新能力都得到了很大提高。這種新的教學(xué)模式適合在我校更大學(xué)生群體中推薦與推廣。

關(guān)鍵詞：綜合拓展實(shí)驗(yàn);創(chuàng)新能力;遺傳轉(zhuǎn)化

高效的人才培養(yǎng)主要是通過(guò)教學(xué)和科研活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。教師在長(zhǎng)期的科研活動(dòng)中所取得的成果，轉(zhuǎn)化為教學(xué)資源，是對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的補(bǔ)充，也是實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式的更新。通過(guò)這種模式縮小了理論與實(shí)踐距離，促進(jìn)了學(xué)生實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力的提高，也促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革。農(nóng)學(xué)專業(yè)是我校傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)專業(yè)，在學(xué)科建設(shè)、基地建設(shè)、實(shí)驗(yàn)室建設(shè)等方面都取得了很大成績(jī)，為了更好地利用這些資源，彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目獨(dú)立、前后項(xiàng)目無(wú)關(guān)聯(lián)、綜合型項(xiàng)目偏少，理論與實(shí)踐聯(lián)系不緊密、學(xué)生動(dòng)手實(shí)操能力不足等問題，結(jié)合教師的科研成果，設(shè)計(jì)了一個(gè)覆蓋本專業(yè)育種學(xué)、基因工程、分子生物學(xué)、植物組織培養(yǎng)等多門主干課程知識(shí)點(diǎn)的綜合型拓展實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：金色穎殼水稻種質(zhì)資源創(chuàng)制研究，該實(shí)驗(yàn)選題結(jié)合實(shí)際，學(xué)生參與感強(qiáng)，在完成綜合型實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生文獻(xiàn)查閱能力、動(dòng)手實(shí)操能力、科研興趣和創(chuàng)新能力都得到了很大提高。

1選題背景

CRISPR/Cas9（clustered regulatory interspersed short palindromic repeat）基因組編輯技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的一種新型靶向基因敲除技術(shù)，由于其突變效率高、制作簡(jiǎn)單及成本低的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具，將對(duì)生物學(xué)的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。本項(xiàng)目在課題組前期研究基礎(chǔ)上擬采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將攜帶了靶標(biāo)位點(diǎn)的CRISPR/Cas9植物基因編輯表達(dá)載體pSK51-Cas9-OsCHI轉(zhuǎn)入水稻受體材料TP309，獲得部分植株并對(duì)其進(jìn)行潮霉素篩選標(biāo)記基因陽(yáng)性鑒定，最終通過(guò)表型鑒定篩選獲得金色穎殼的突變植株，為后續(xù)深入研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

選用水稻TP309成熟種子，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，通過(guò)水稻愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織的農(nóng)桿菌浸染及共培養(yǎng)、抗性愈傷組織的篩選、抗性愈傷組織的潮霉素基因特異引物檢測(cè)、T代植株再生等幾個(gè)步驟完成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路完整，各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之間聯(lián)系緊密，內(nèi)容涉及多學(xué)科知識(shí)點(diǎn)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

對(duì)pSK51-Cas9-OsCHI農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行活化、懸浮后，使用適當(dāng)濃度的農(nóng)桿菌菌液侵染受體水稻品種TP309的胚性愈傷組織;經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)后，將愈傷組織接入到篩選培養(yǎng)基（含50mg/L潮霉素）上;經(jīng)過(guò)2次篩選后，愈傷組織的生長(zhǎng)得到明顯的抑制。挑選增殖明顯的、生長(zhǎng)良好的陽(yáng)性抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，經(jīng)分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)過(guò)程后，攜帶了靶標(biāo)位點(diǎn)的CRISPR/Cas9植物基因編輯表達(dá)載體pSK51-Cas9-OsCHI獲得了轉(zhuǎn)化苗（圖1）。

3.2抗性愈傷組織的潮霉素基因特異引物檢測(cè)

取篩選培養(yǎng)基上的抗性愈傷組織用鑷子夾碎成兩半，一半接種到分化培養(yǎng)基上，另一半于55℃干燥箱中烘2h后提取DNA，然后進(jìn)行潮霉素基因特異引物分子檢測(cè)，結(jié)果表明，大部分的抗性愈傷組織都呈現(xiàn)潮霉素陽(yáng)性（圖2）。

M：DNA ladder;l：清水對(duì)照;2：野生型陰牲對(duì)照;

3-13：陽(yáng)性抗性愈傷組織

圖2抗性愈傷組織潮霉素引物PCR陽(yáng)性鑒定

3.3植株的表型觀察

將經(jīng)過(guò)煉苗的植株移栽一段時(shí)間后，突變體在抽穗期，呈現(xiàn)出明顯不同于野生品種的金色穎殼（圖3）。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，除了稻穎變成金色，種子形狀和其他性狀均沒有發(fā)現(xiàn)異常。這些結(jié)果表明，本綜合拓展實(shí)驗(yàn)成功獲得了通過(guò)定向編輯水稻OsCHI基因的金色水稻種質(zhì)資源。

4教學(xué)實(shí)施

農(nóng)學(xué)專業(yè)學(xué)生經(jīng)過(guò)兩年的學(xué)習(xí)，已經(jīng)完成了生物化學(xué)、基因工程、植物組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)相關(guān)課程的理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能的學(xué)習(xí)，因此，該綜合性實(shí)驗(yàn)安排在大三上學(xué)期，4～16周的課余時(shí)間。此次綜合拓展實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是首次開設(shè)，充分尊重學(xué)生的意愿和興趣，在大二下學(xué)期課程結(jié)束前兩周，指導(dǎo)教師把實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的內(nèi)容、目的、要求及大致實(shí)驗(yàn)方案等以PPT的形式通過(guò)QQ和微信等網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)發(fā)放給學(xué)生，學(xué)生自愿報(bào)名參加。大部分學(xué)生持觀望態(tài)度、少部分學(xué)生不感興趣，最終報(bào)名學(xué)生8人。為了便于后期研討與管理，將8名學(xué)生分成兩組，每組4人（1名組長(zhǎng)，3名成員）。實(shí)驗(yàn)前2周，教師召集所有學(xué)生布置實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作，并給學(xué)生發(fā)放實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目相關(guān)資料，要求每組學(xué)生根據(jù)資料信息整理出詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)，然后發(fā)回給指導(dǎo)老師修改完善。方案定好后，開始正式實(shí)施。正式實(shí)施階段每隔一個(gè)禮拜，組長(zhǎng)要給教師匯報(bào)本周實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，共同探討前期實(shí)驗(yàn)效果及后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排。實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，每個(gè)學(xué)生要提交一份完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告和一份實(shí)驗(yàn)心得體會(huì)。

5教學(xué)效果

在本次拓展項(xiàng)目中，學(xué)生作為主體參與了實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)過(guò)程及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，最終取得如下實(shí)踐成果：（1）熟練掌握了水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系及鑒定工作，學(xué)會(huì)了規(guī)范化操作流程，提高了動(dòng)手實(shí)踐能力。（2）精通文獻(xiàn)檢索和查閱技能，為畢業(yè)論文和項(xiàng)目申報(bào)書的書寫及參與科研工作提供了便利。其中5個(gè)學(xué)生加入指導(dǎo)教師科研團(tuán)隊(duì)，從事簡(jiǎn)單科研工作，并發(fā)表核心期刊論文2篇。（3）通過(guò)完成拓展項(xiàng)目，開闊了學(xué)生視野，豐富了學(xué)生課余生活，也為申報(bào)各類競(jìng)賽項(xiàng)目做了鋪墊。8個(gè)學(xué)生以團(tuán)隊(duì)的形式在不到2年時(shí)間里，成功申請(qǐng)了2項(xiàng)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)踐項(xiàng)目。（4）學(xué)生積極了解本專業(yè)最新科研動(dòng)態(tài)，增強(qiáng)了學(xué)生的科研探索意識(shí)，培養(yǎng)了科研興趣。參與的8名學(xué)生有7名同學(xué)分別考取了中山大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、長(zhǎng)江大學(xué)的研究生。

6小結(jié)

綜合型拓展實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目選題來(lái)自教師科研部分成果，是科研反哺教學(xué)的體現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到的操作技術(shù)融合了分子生物學(xué)、基因工程、植物組織培養(yǎng)等多門學(xué)科的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，把獨(dú)立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目連接成一個(gè)整體，有利于學(xué)生形成良好的知識(shí)架構(gòu)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)學(xué)生收獲了水稻穎殼顏色突變的植株，為該技術(shù)在水稻育種生產(chǎn)上的進(jìn)一步應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。縮小了理論向?qū)嵺`轉(zhuǎn)化的距離，體現(xiàn)了知識(shí)的應(yīng)用價(jià)值。總之，這種新的教學(xué)模式在小范圍學(xué)生中的實(shí)施已取得較好效果，在后續(xù)的教學(xué)過(guò)程中，為了覆蓋更多的學(xué)生群體，將從項(xiàng)目選題多樣化和引入不同的教師科研團(tuán)隊(duì)進(jìn)行推廣和實(shí)施兩個(gè)方面進(jìn)一步優(yōu)化，為最終培養(yǎng)適應(yīng)社會(huì)需求、綜合能力強(qiáng)的高質(zhì)量本科人才提供參考。

*通訊作者：沈春修（1979— ），男，漢族，湖南溆浦人，副教授，研究方向：作物遺傳育種教學(xué)與科研。