生物法降解黃曲霉毒素B1的研究進(jìn)展

謝慧，高蕾，趙丹丹，張宏森，毛國(guó)濤，王風(fēng)芹，宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州， 450002)

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織估計(jì)，全世界25%的谷物供應(yīng)受真菌毒素污染，其中2%的糧食由于發(fā)生霉變而不能食用[1]。農(nóng)作物污染給食品工業(yè)、飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了重大問(wèn)題，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，已引起全球的廣泛關(guān)注[2-3]。真菌毒素種類繁多，其中黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是迄今發(fā)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品污染中毒性最強(qiáng)的一類生物毒素，對(duì)人類和動(dòng)物具有極強(qiáng)的致突變、致癌和致畸性[4]。玉米、小麥、高粱、花生餅、豆粕、棉籽粕、玉米秸稈等農(nóng)產(chǎn)品因貯存不當(dāng)或其他原因都會(huì)污染AF[5]，這些原料經(jīng)污染后，AF含量可高達(dá)50～80 μg/kg，遠(yuǎn)高于中國(guó)規(guī)定的最高限量標(biāo)準(zhǔn)20 μg/kg[6]。在動(dòng)物生產(chǎn)中，一旦日糧(如小麥、麩皮、玉米、豆粕等)被AF污染，輕則導(dǎo)致動(dòng)物體增重降低，飼料轉(zhuǎn)化率下降，重則誘發(fā)腫瘤和癌癥，甚至死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。人類攝入AF后，被細(xì)胞色素P450酶代謝形成活性中間體，與肝細(xì)胞相互作用引起肝癌[8]。因此防止貯存過(guò)程中原料發(fā)生霉變是食品與飼料生產(chǎn)過(guò)程中的必要環(huán)節(jié)，同時(shí)對(duì)于已發(fā)生霉變的食品與飼料原料，如何高效去除AF就成為當(dāng)今亟待解決的重大問(wèn)題。本文對(duì)生物法降解AF進(jìn)行了闡述，重點(diǎn)介紹了微生物和昆蟲(chóng)對(duì)AFB1的降解作用及降解機(jī)制，為后續(xù)生物法降解AF提供理論依據(jù)。

1 AF的去除

AF有20多種，常見(jiàn)的有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。其中AFB1的毒性最強(qiáng)，因此被用來(lái)作為AF的評(píng)價(jià)指標(biāo)[9]。目前市場(chǎng)上常用的降解AF的方法主要有物理方法，化學(xué)方法和生物方法。物理法通過(guò)高溫加熱、紫外線照射等使AFB1結(jié)構(gòu)破壞或通過(guò)吸附劑將AFB1吸附從而達(dá)到去除AFB1的效果[10-12]。MARKOV等[13]利用5kGy γ-射線對(duì)47個(gè)污染的玉米樣品進(jìn)行照射，AFB1去除率可達(dá)69.8%，而經(jīng)10-kGy γ-射線照射后，AFB1的去除率提高到94.5%。物理法操作簡(jiǎn)單，但是去除效率低且耗時(shí)。化學(xué)法去除AFB1的方法包括強(qiáng)氧化劑和堿處理，通過(guò)打開(kāi)AFB1的某些化學(xué)鍵從而達(dá)到去除效果[14-15]。將污染AFB1的花生放置到臭氧發(fā)生器中，熏蒸60 h后，檢測(cè)到89.4%的AFB1被降解[16]。研究發(fā)現(xiàn)，弱堿高溫處理法對(duì)花生原料中AFB1有較好的去除效果，在121 ℃，pH 10條件下將花生粕處理60 min，AFB1降解率高達(dá)84.50%，將花生油在23.42%堿濃度下進(jìn)行處理，AFB1含量從34.78 μg/kg下降到0.37 μg/kg[17]?；瘜W(xué)法操作簡(jiǎn)單、去除效果佳，但化學(xué)試劑會(huì)嚴(yán)重破壞飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)飼料造成二次污染。

生物法主要是利用微生物或酶制劑進(jìn)行脫毒。FARZANEH等[18]分離出1株枯草芽孢桿菌UTBSP1(BacillussubtilisUTBSP1)，該菌株可以降解肉湯培養(yǎng)基中AFB1，降解率達(dá)到85.66%。TOPCU等[19]研究了屎腸球菌(Enterococcusfaecium)降解AFB1的能力，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)48 h后，大約有40%的AFB1被降解。生物降解法是目前最環(huán)保最高效的降解方法，不僅可以有效降解毒素，還能提高飼料或食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不會(huì)造成二次污染。

2 生物法降解AFB1

2.1 微生物對(duì)AFB1的降解作用

微生物法降解 AFB1已經(jīng)逐漸成熟，近幾年，發(fā)現(xiàn)多種微生物對(duì)AFB1具有顯著的降解作用。例如，嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、藤黃單胞菌(Luteimonassp.)、泉水單胞菌(Silanimonassp.)、溶桿菌 (Lysobactersp.)、乳酸桿菌(Lactobacillussp.)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和 紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)等等。大多數(shù)研究者通過(guò)高通量測(cè)序如利用香豆素平板篩選出解毒效率高的優(yōu)勢(shì)菌株，表1為降解AFB1的部分菌株。

2.1.1 細(xì)菌對(duì)AFB1的降解作用

利用細(xì)菌對(duì)AFB1進(jìn)行高效降解是解決AF污染的一大研究熱點(diǎn)。WAN等[20]觀察到地衣芽孢桿菌BL010(BacilluslicheniformisBL010)具有較高的AFB1降解活性，是一種高效的AFB1降解菌株。SHU等[21]利用香豆素培養(yǎng)基分離到1株具有較強(qiáng)AFB1降解活性的細(xì)菌，鑒定為芽孢桿菌DY3108(BacillusvelezensisDY3108)，進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)其AFB1降解活性主要來(lái)源于菌株無(wú)細(xì)胞上清液，對(duì)蛋白酶K處理具有熱穩(wěn)定性和抗性，對(duì)十二烷基硫酸鈉處理具有敏感性，耐高溫且最適pH值寬泛。KARUNARATNE等[22]測(cè)定了3種乳酸桿菌(Lactobacillusp.)對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)和AF產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，3種乳酸桿菌能有效地抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)，并能有效地減少AF的產(chǎn)生。SANGI等[23]分離出5株AFB1降解菌株，分別為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、3株擬灰色赭桿菌(Ochrobactrumpseudogrigonens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和陰溝腸桿菌(Enterobactercloace)，降解活性分別達(dá)到88%、78%、61%、58%和51%，這是首次證實(shí)了短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)對(duì)AFB1的降解，并首次報(bào)道了擬灰色赭桿菌(Ochrobactrumpseudogrigonens)和陰溝腸桿菌(Enterobactercloace)具有AFB1降解活性。XU等[24]測(cè)定了從玉米、水稻和土壤樣本中采集的43個(gè)細(xì)菌菌株的AFB1降解活性，分離出活性較高的菌株L7，鑒定為沙克氏桿菌(Bacillusshackletonii)。SILIVANO等[25]發(fā)現(xiàn)擬香味類香味菌3 J2MO(Myroidesodoratimimusstrain 3 J2MO)能很好地降解AFB1，采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定AFB1的含量，結(jié)果表明，在37 ℃ LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，約93.82%的AFB1被降解，該菌在農(nóng)產(chǎn)品和食品工業(yè)基質(zhì)中都有潛在的AF污染生物防治策略的生物修復(fù)和解毒作用。CHLEBICZ等[26]研究了12株乳酸桿菌和6株釀酒酵母對(duì)AF的降解作用，乳酸桿菌平均解毒效率為60%，酵母平均解毒效率為65%。WANG等[27]從雞盲腸篩出1株具有AFB1降解能力的菌株，用高效液相色譜法測(cè)定AFB1降解率為93.7%，經(jīng)16S rDNA基因序列分析和多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)鑒定為非致病性大腸桿菌CG1061(EscherichiacoliCG1061)。細(xì)菌是AFB1降解菌株的主力軍，但是其研究?jī)?nèi)容較為簡(jiǎn)單，只是研究了降解率、最適溫度、最適pH和有效降解成分的性質(zhì)，因此對(duì)細(xì)菌降解機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

表1 AFB1降解菌株Table 1 Aflatoxin B1 degradation strain

2.1.2 真菌對(duì)AFB1的降解作用

真菌降解AF對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)和飼料利用更具實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。降解AF的真菌主要包括雜色云芝(Trametesversicolor)、白腐真菌(Phanerochaete)和黑曲霉(Aspergillusniger)等。DAS等[28]將發(fā)霉的秸稈與不同菌株進(jìn)行共培養(yǎng)，利用高效液相色譜法測(cè)定AFB1的降解程度，發(fā)現(xiàn)黃曲霉MTCC 2798與糙皮側(cè)耳菌GHBBF10(PleurotusostreatusGHBBF10)共培養(yǎng)時(shí)，AFB1降解率可達(dá)89.41%，該菌株可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，有效降解發(fā)霉稻草中的AFB1。ROOHOLLA等[29]研究了乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)在30 ℃下孵育7 d，酵母最低群體濃度為1.5×105CFU/mL時(shí)，乳酸克魯維酵母抑制了黃曲霉的生長(zhǎng)，并使AF的總產(chǎn)量降低了97.9%，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2分別降解了97.8%、98.6%、98%和94%。WANG等[30]對(duì)白腐菌(Phanerochaetesordida)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌可去除86.0%的AFB1。與細(xì)菌降解相比較，大多數(shù)真菌存在降解AFB1時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣和降解率低的問(wèn)題，大大限制了真菌在工業(yè)上的實(shí)際應(yīng)用。李冰等[31]利用黑曲霉(Aspergillusniger)降解AFB1，液相色譜法測(cè)定AFB1含量，結(jié)果表明在處理72 h后，黑曲霉對(duì)AFB1的降解率高達(dá)93.28%，其中在12 h時(shí)，降解率已達(dá)到63.48%，分離菌體細(xì)胞與胞外粗提液，分別測(cè)定降解能力，發(fā)現(xiàn)胞外粗提液AFB1降解能力最強(qiáng)(84.20%)，推測(cè)是由于黑曲霉細(xì)胞壁的吸附作用、胞內(nèi)物質(zhì)的降解作用共同去除AFB1。ZJALIC等[32]凍干不同的雜色云芝(Trametesversicolor)提取液，通過(guò)一系列步驟提取胞外多糖和糖蛋白，添加到寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的液體培養(yǎng)基中，對(duì)寄生曲霉的菌絲生長(zhǎng)和AF的產(chǎn)生進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中1株雜色云芝在9 d完全抑制了分生孢子的萌發(fā)和曲霉菌絲的生長(zhǎng)，另外2株在3～6 d起抑制作用。

2.2 昆蟲(chóng)對(duì)AFB1的降解作用

昆蟲(chóng)作為一種營(yíng)養(yǎng)豐富、高效、可持續(xù)的動(dòng)物蛋白和熱量來(lái)源，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。一些昆蟲(chóng)由于其在特殊的自然環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖，能夠以受到霉菌毒素污染的營(yíng)養(yǎng)食物為能源，因此在昆蟲(chóng)進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)對(duì)霉菌毒素以及其他毒素產(chǎn)生了應(yīng)對(duì)能力。NIU等[33]發(fā)現(xiàn)臍橙螟對(duì)AFB1和赭霉毒素A具有極高的耐受性，推測(cè)其耐受性可能是由于昆蟲(chóng)的解毒能力，產(chǎn)生了無(wú)毒的代謝產(chǎn)物。VAN-BROEKHOVEN等[34]發(fā)現(xiàn)未受污染飼糧處理的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)與受污染飼糧處理的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)體重增加無(wú)差異，且存活率都較高，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析了幼蟲(chóng)和幼蟲(chóng)糞便中霉菌毒素的存在情況，都未檢出受污染飼糧或受污染飼糧衍生物，說(shuō)明霉菌毒素被幼蟲(chóng)降解。NIERMANS等[35]發(fā)現(xiàn)玉米烯酮不會(huì)在黃粉蟲(chóng)的幼蟲(chóng)體內(nèi)積累，并且黃粉蟲(chóng)能夠代謝和排泄霉菌毒素，其降解產(chǎn)物主要是玉米烯酮的偶聯(lián)物。CAMENZULI等[36]在黑蠅蟲(chóng)和黑蠅幼蟲(chóng)的飼料中添加AFB1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(fusarium oxysporum enol, DON)、赭霉毒素A(ochatoxin A, OTA)和玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)的混合物，其濃度分別為歐盟委員會(huì)規(guī)定的完全飼料最高濃度的1倍、10倍和25倍，所有霉菌毒素均未在幼蟲(chóng)體內(nèi)積累，質(zhì)量平衡計(jì)算表明黑蠅蟲(chóng)和黑蠅幼蟲(chóng)對(duì)4種霉菌毒素有不同程度的代謝，其代謝物為黃曲霉毒醇，AFP1，AFQ1和AFM1，3-乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyl-DON), 15-乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyl-DON)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-糖苷(DON-3-glycoside)，α-和β-玉米赤霉烯。BOSCH等[37]研究表明，用添加AFB1的家禽飼料喂養(yǎng)黑水虻幼蟲(chóng)和黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)，其飼料中AFB1含量分別為0.01、0.025、0.05、0.10、0.25和0.5 mg/kg，對(duì)黑水虻幼蟲(chóng)和黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)的存活率和體重沒(méi)有影響，結(jié)果表明黑水虻幼蟲(chóng)和黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)均具有較高的AFB1耐受性，且不積累AFB1。此外，黃粉蟲(chóng)對(duì)惡劣的生活環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)。YANG等[38-39]發(fā)現(xiàn)黃粉蟲(chóng)能夠?qū)⒕郾揭蚁┧芰贤耆到獾V化為CO2或同化為蟲(chóng)體脂肪，且以聚苯乙烯為食的黃粉蟲(chóng)的存活率與對(duì)照組無(wú)明顯差別，首先黃粉蟲(chóng)將聚苯乙烯咀嚼成小碎片，并攝入腸道，攝入的片段與腸道微生物區(qū)系混合，腸道微生物區(qū)系分泌細(xì)胞外酶，催化片段解聚成小分子產(chǎn)物，從黃粉蟲(chóng)腸道篩選出1株能夠?qū)⒕郾揭蚁┧芰献鳛槲ㄒ坏纳L(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)菌，命名為微小桿菌YT2(ExiguobacteriumYT2)，該菌株被證實(shí)能夠降解聚苯乙烯，說(shuō)明腸道菌群在黃粉蟲(chóng)降解外源物質(zhì)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

3 生物法降解AFB1的機(jī)制

AFB1結(jié)構(gòu)式中含有1個(gè)雙呋喃環(huán)和1個(gè)氧雜萘鄰?fù)醒芯勘砻髑罢邽榘l(fā)揮毒性作用的主要基團(tuán)，而后者主要與致癌性有關(guān)[40]。目前關(guān)于物理法和化學(xué)法對(duì)AFB1降解機(jī)理的研究報(bào)道較少，大多數(shù)報(bào)道只是利用液相與質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定AFB1降解產(chǎn)物分子式，二級(jí)質(zhì)譜對(duì)比庫(kù)或利用軟件推測(cè)降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式，根據(jù)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析出AFB1降解途徑[20,41-42]，而涉及生物降解AFB1機(jī)理的相關(guān)報(bào)道較多，主要包括酶降解AFB1、揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)AFB1的影響、AFB1相關(guān)基因的表達(dá)等。

3.1 酶降解AFB1

酶作為AFB1降解機(jī)制研究中起催化作用的主要組成，在AFB1的生物法降解研究中占據(jù)了重要地位。WANG等[30]利用白腐菌YK-624(PhanerochaetesordidaYK-624)的錳過(guò)氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)對(duì)AFB1進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)86%的AFB1被去除，通過(guò)UMU試驗(yàn)(DNA損傷物誘導(dǎo)應(yīng)急反應(yīng)表達(dá)umuC基因的能力)得知MnP顯著降低了AFB1的致突變活性，而20 nkat MnP處理AFB1即可使其誘變活性降低69.2%，如圖1所示，氫核磁共振譜(H-nuclear magnetic resonance spectroscopy，H-NMR)和高分辨率電噴霧質(zhì)譜(high-resolution electrosprayionization mass spectrometry，HR-ESI-MS)分析表明，AFB1首先被MnP氧化成AFB1-8,9-環(huán)氧化物，然后水解成AFB1-8,9-二氫二醇，這是首次報(bào)道MnP通過(guò)將AFB1轉(zhuǎn)化為AFB1-8,9-二氫二醇來(lái)有效去除AFB1的致突變活性。WAN等[20]在對(duì)地衣芽孢桿菌BL010(BacilluslicheniformisBL010)的研究中發(fā)現(xiàn)并證明了其無(wú)細(xì)胞提取物在AFB1的降解中起重要作用，利用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了2個(gè)降解酶基因漆酶和幾丁質(zhì)酶基因(Lac010和Chia010)，對(duì)Lac010和Chia010中的保守位點(diǎn)和可變位點(diǎn)進(jìn)行多重序列比對(duì)，以確定在蛋白水平上的序列相似性，分析確定了這2種酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的同源性建模和功能預(yù)測(cè)提供了重要依據(jù)，對(duì)Lac010和Chia010構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明Chia010與地衣芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的遺傳距離較短，Lac010與枯草芽孢桿菌亞種之間的遺傳距離較短。XU等[24]在對(duì)沙克氏桿菌L7(BacillusshackletoniiL7)的研究中發(fā)現(xiàn)，其上清液對(duì)AFB1的降解率高于活細(xì)胞和細(xì)胞提取物，在蛋白酶K(protease K)和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)存在下，AFB1降解率有所下降，從煮沸上清液中純化出一種耐熱酶，稱為AF降解酶，這也是首次報(bào)道了從沙克氏桿菌中分離出的一種AF降解酶，它在食品和飼料加工中對(duì)AF的解毒具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。SONG等[43]對(duì)M19型銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaM19)降解AF進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)分別添加蛋白酶K、SDS和加熱后，銅綠假單胞菌M19培養(yǎng)上清液的降解能力顯著降低，推測(cè)存在AF降解酶，采用硫酸銨分步沉淀、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析三步程序從假單胞菌中分離出AF降解酶，使其成為一種很有前景的AFB1生物降解候選物。XIE等[44]利用二乙氨基乙醇-瓊脂糖色譜法從泛生菌T6(Pantoeasp.T6)上清液中分里出一種胞外酶，命名為AF降解酶，用質(zhì)譜法鑒定為外膜蛋白A，這是首次報(bào)道泛生菌T6可以分泌外膜蛋白A出膜并降解AFB1。

圖1 錳過(guò)氧化物酶氧化AFB1的機(jī)理Fig.1 Proposed mechanism of AFB1 oxidation by MnP

3.2 揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)AFB1的影響

文獻(xiàn)報(bào)道表明，揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds, VOCs)對(duì)真菌病原菌具有顯著的抗真菌活性[45-48]。一些微生物通過(guò)揮發(fā)性有機(jī)化合物的釋放，如鏈霉菌和芽孢桿菌等，對(duì)植物病原菌顯示出巨大的潛在生物作用[49-53]。YANG等[54]研究了鏈霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)中揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)黃曲霉的抑菌作用，利用2個(gè)面對(duì)面無(wú)蓋培養(yǎng)皿，將鏈霉菌TD-1置于下方，黃曲霉菌置于上方，結(jié)果發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性有機(jī)化合物對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，此前關(guān)于利用鏈霉菌揮發(fā)性有機(jī)化合物抑制黃曲霉的報(bào)道很少。LYU等[55]在對(duì)鏈霉菌3-10(Streptomycesyanglinensis3-10)的研究中也發(fā)現(xiàn)了可揮發(fā)性有機(jī)化合物在體外能抑制黃曲霉和寄生黃曲霉的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)和AF生物合成基因的表達(dá)，通過(guò)掃描電鏡觀察表明，高劑量的可揮發(fā)性化合物可抑制2種曲霉菌在花生籽粒上的分生孢子萌發(fā)和定殖，采用固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)19種主要揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中2-甲基異莰醇是主要揮發(fā)性成分，2-甲基丁酸甲酯、2-苯乙醇和β-石竹烯3種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)對(duì)黃曲霉和寄生曲霉均具有抗真菌活性，其中2-甲基丁酸甲酯對(duì)黃曲霉和寄生曲霉孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，這是2-甲基丁酸甲酯對(duì)黃曲霉和寄生曲霉抗真菌活性的首次報(bào)導(dǎo)。BOUKAEW等[56]采用同樣的方式在PDA平板上進(jìn)行抗真菌生物測(cè)定，結(jié)果表明鏈霉菌RL-1-178(StreptomycesphilanthiRL-1-178)對(duì)寄生曲霉TISTR 3276(AspergillusparasiticusTISTR 3276)和黃曲霉PSRDC-4(AspergillusflavusPSRDC-4)表現(xiàn)出抑制作用(圖2)，通過(guò)氣相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)鑒定出39種化合物，其中含量最多的物質(zhì)是土臭(3.75%)，其次是41種L-芳樟醇(13.55%)，2-巰基乙醇(9.71%)和庚烷(5.96%)。土臭素，L-芳樟醇和2-巰基乙醇完全抑制了菌絲體的生長(zhǎng)，庚烷的抑制作用僅為45.7%。在貯存的大豆種子上使用可揮發(fā)性化合物作為生物熏蒸劑，可以完全保護(hù)種子免受感染，并完全抑制AFB1、AFB2和AFG2的產(chǎn)生，這些發(fā)現(xiàn)表明，揮發(fā)性有機(jī)化合物可以用作生物熏蒸劑，以抑制貯存的種子中2種真菌的生長(zhǎng)和AF的生成。由于揮發(fā)性有機(jī)化合物的特性，有關(guān)其降解AFB1的研究逐漸增多，可揮發(fā)性有機(jī)化合物將成為生物法降解AFB1的一大熱點(diǎn)。

a-鏈霉菌RL-1-178;b-單獨(dú)接種黃曲霉PSRDC-4；c-單獨(dú)接種寄生 曲霉TISTR 3276;d-共同接種黃曲霉PSRDC-4和鏈霉菌RL-1-178圖2 鏈霉菌RL-1-178對(duì)寄生曲霉TISTR 3276 黃曲霉PSRDC-4的抑制作用Fig.2 Inhibition of Streptomyces TL-1-178 on Aspergillus parasiticus TISTR 3276 and Aspergillus flavus PSRDC-4

3.3 AFB1生物合成基因的表達(dá)

生物法降解AFB1的研究深入到基因?qū)用妗OOHOLLA等[29]將乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)與寄生霉菌共培養(yǎng)，采用實(shí)時(shí)PCR方法分析了乳酸克魯維酵母孵育48 h后β-actin和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aflR mRNA的表達(dá)水平，β-actin結(jié)果表示寄生曲霉在乳酸克魯維酵母存在下表現(xiàn)出穩(wěn)定性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)用1.5×105CFU/mL的乳酸克魯維酵母處理后，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aflR基因表達(dá)明顯下降(P<0.05)，表明乳酸克魯維酵母能夠抑制黃曲霉菌生物合成基因的表達(dá)。YANG等[54]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定在揮發(fā)性有機(jī)化合物的影響下，AF生物合成的基因表達(dá)變化，結(jié)果顯示在鏈霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)的可揮發(fā)性有機(jī)化合物處理下，LaeA和vea表達(dá)較對(duì)照組下降5.46倍和29.50倍，2個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aflR和aflS分別下調(diào)了6.98倍和19.27倍，并且其他4個(gè)結(jié)構(gòu)基因aflD、aflM、aflP和aflQ在7.35～35.59倍下調(diào)，表明可揮發(fā)性有機(jī)化合物通過(guò)影響AF生物合成的相關(guān)基因表達(dá)，直接降低AF的產(chǎn)生。通過(guò)研究黃曲霉菌內(nèi)一系列合成AF基因的表達(dá)，揭示生物法降解AF的機(jī)理，為生物法的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，為基因改造降解AF的菌株提供了新的思路。

4 展望

生物法由于其無(wú)污染、具有特異性高、溫和、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)成為近年來(lái)AF降解研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。微生物降解AF成為研究的主要方向，但是目前報(bào)道的絕大多數(shù)微生物脫毒菌種在實(shí)際應(yīng)用中存在如下兩方面的共性問(wèn)題：(1)有部分微生物對(duì)AFB1起吸附作用，通過(guò)食物鏈循環(huán)進(jìn)入動(dòng)物或人體，在體內(nèi)發(fā)生解吸附作用，從而使AFB1進(jìn)入動(dòng)物或人體，造成傷害，此類微生物并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)生物降解，無(wú)脫毒意義；(2)已報(bào)道的菌種對(duì)AF的脫毒時(shí)間一般都在72 h，脫毒時(shí)間較長(zhǎng)，而且降解效率普遍較低，實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值不大。因此，需要尋找能夠高效降解AF的菌種，真正應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全領(lǐng)域。

目前，關(guān)于AF降解酶報(bào)道相對(duì)較少，大多數(shù)酶的降解率不高且用時(shí)長(zhǎng)，導(dǎo)致毒素不能被完全降解[43-44]。因此，利用基因工程的手段對(duì)微生物菌種進(jìn)行篩選及改造，獲得降解酶在體外的高效表達(dá)，開(kāi)發(fā)出能夠高效降解AF的生物菌種，進(jìn)而為實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物資源的無(wú)毒化和高值化利用提供技術(shù)支持，為進(jìn)一步推進(jìn)我國(guó)食品與飼料安全奠定基礎(chǔ)。