響應(yīng)面優(yōu)化羊肉負(fù)離子電場腌制工藝

樊沙娜，李斯琦，劉彥秋，白楊，都日瑪，莎日娜

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010018)

負(fù)離子電場(靜電場)是通過電板中填充高分子材料，當(dāng)通電時(shí)分子之間相互碰撞、摩擦等物理作用，會使電板中產(chǎn)生巨大的能量，積累的能量導(dǎo)致電板中電位迅速增加而產(chǎn)生大量靜電運(yùn)動。這些靜電運(yùn)動的材料會向環(huán)境放電并將負(fù)電荷擴(kuò)散到環(huán)境中，從而在一定空間范圍內(nèi)長時(shí)間制造負(fù)離子的氛圍[1-5]。目前國內(nèi)外研究負(fù)離子電場的應(yīng)用主要集中在果蔬、肉類的保鮮方面。高壓靜電場處理可以減少鮮核桃青皮中總酚的損失，降低腐爛指數(shù)，延長保鮮期[6]；在高壓靜電場條件下解凍兔肉優(yōu)于常規(guī)解凍，而且不會造成兔肉的脂質(zhì)氧化[7]；可以最大限度延長冷凍生鮮食品保鮮期[8-10]。DENBA+靜電場處理有效地加快了豬肉的凍結(jié)速率，降低脂肪氧化速率和嫩度，減少冷藏豬肉菌落總數(shù)[11]等。將肉類置于負(fù)離子電場中腌制可利用負(fù)離子電場使分子運(yùn)動加快、抑制微生物繁殖、降低脂肪氧化速率等作用，對傳統(tǒng)腌制技術(shù)的不足進(jìn)行改善[12-13]。本試驗(yàn)將腌制技術(shù)與負(fù)離子電場結(jié)合，用Box-Behnken設(shè)計(jì)與響應(yīng)面法優(yōu)化負(fù)離子電場腌制工藝，獲得腌制的最佳工藝，為負(fù)離子腌制技術(shù)降低腌制肉品脂肪氧化提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羊后腿肉，采樣于內(nèi)蒙古錫林古勒盟蘇尼特羊繁育基地；食鹽，呼和浩特市家樂福超市；NaNO2、抗壞血酸(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；GZX-9數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒儀器有限公司；磁力攪拌器，常州易晨儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器責(zé)任有限公司；靜電磁場裝置，呼和浩特市綠碧電子設(shè)備有限公司；

1.3 方法

1.3.1 原料肉處理

將冷凍的蘇尼特羊后腿肉在4 ℃條件下隔夜解凍，解凍后的肉切成5 cm×5 cm×5 cm的肉塊，然后用注射器將混合好的腌制液注入肉塊中，將肉塊放在封閉的容器內(nèi)腌制，腌制后進(jìn)行測定。

試驗(yàn)腌制液：每100 g優(yōu)質(zhì)羊后腿肉，用100 mL水分別溶解0.1 g NaNO2和1 g抗環(huán)血酸，試驗(yàn)前將配制好的2種研制液放于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 腌制方法

新型負(fù)離子電場腌制：稱取250 g肉樣，通過注射器將25 mL NaNO2溶液和12.5 mL抗壞血酸混合溶液注入肉塊中，然后撒入6.25 g食鹽，在容器內(nèi)用手揉捻、翻動數(shù)下，用封口膜封口進(jìn)行腌制。為腌制均勻，每6 h上下翻動1次。

1.3.3 負(fù)離子電場對羊肉肌紅蛋白總量及相關(guān)色素的測定

取肉樣20 g，加入20 mL濃度為0.04 mol/L，pH 6.8的磷酸鈉緩沖劑,用快速攪拌器在室溫下均質(zhì)20 s。然后將樣品于冰浴中冰浴1 h，取出于8 000 r/min、4 ℃下離心20 min。將上清液用濾紙過濾，用同樣的緩沖液加至刻度25 mL。使用TU-1810紫外可見風(fēng)光光度計(jì)測定在525、545、565和572 nm 處的吸光率。肌紅蛋白總量及脫氧肌紅蛋白(deoxyMb)、氧合肌紅蛋白(MbO2)等及高鐵肌紅蛋(MetMb)各部分的比例按照孟宇竹等[14]方法，計(jì)算如公式(1)～公式(4)所示：

肌紅蛋白總量(mmol·L-1)=-0.166A572+0.086A565+0.088A545+0.099A525

(1)

脫氧肌紅蛋白/%=(0.369R1+1.140R2-0.941R3+0.015)×100

(2)

氧合肌紅蛋白/%=(0.882R1-1.267R2+0.809R3-0.361)×100

(3)

高鐵肌紅蛋白/%=(-2.541R1+0.777R2+0.800R3+1.098)×100

(4)

式中：Rl、R2、R3分別是吸光率比值A(chǔ)572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.3.4 單因素試驗(yàn)變量因素設(shè)定

在固定腌制劑加入量下，設(shè)置各因素水平為腌制溫度(0、2、4、6、8 ℃)、腌制場強(qiáng)(0、1、3、5、7 kV)、腌制時(shí)間(10、11、12、13、14 h)對腌肉肌紅蛋白相關(guān)量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)Box -Behnken中心設(shè)計(jì)原理，結(jié)合負(fù)離子電場腌制工藝，選擇場強(qiáng)、腌制溫度和腌制時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以腌制肉的氧合肌紅蛋白含量的結(jié)果為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，見表1。所有測定試驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)處理重復(fù)3次取平均值，數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel進(jìn)行分析，采用Box-Behnken法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05。應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Variables and levels used in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 腌制溫度對腌肉中肌紅蛋白相關(guān)色素的影響

不同腌制溫度對腌肉中肌紅蛋白相關(guān)色素的影響如圖1所示。

圖1 腌制溫度對腌肉中肌紅蛋白相關(guān)色素的影響Fig.1 Effect of different pickling temperature on myoglobin related pigment in cured meat

肉制品的顏色是評價(jià)肉的重要指標(biāo)，肉制品的顏色主要由肉中的脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白含量決定，在一定范圍內(nèi)氧合肌紅蛋白含量越高肉的色澤越鮮紅，相反高鐵肌紅蛋白含量越低肉的色澤越鮮紅[15-16]。由圖1可知，氧合肌紅蛋白含量隨著溫度的升高先增加后減小，在4 ℃時(shí)達(dá)到最大值，高鐵肌紅蛋白含量隨著腌制溫度呈減小趨勢；相反，脫氧肌紅蛋白的含量隨著腌制溫度的升高呈增加趨勢。綜合比較腌制后6 ℃時(shí)肉的顏色與新鮮原料肉的顏色最接近，所以將6 ℃確定為腌制效果最佳溫度。因此選擇腌制溫度4、6、8 ℃進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 腌制時(shí)間對腌肉中肌紅蛋白相關(guān)色素的影響

不同腌制時(shí)間對腌肉中肌紅蛋白相關(guān)色素的影響如圖2所示。

圖2 腌制時(shí)間對腌肉中肌紅蛋白相關(guān)色素的影響Fig.2 Effect of different pickling time on myoglobin related pigment in cured meat

隨著腌制時(shí)間的延長氧合肌紅蛋白含量和脫氧肌紅蛋白含量整體呈先增加后減小的趨勢；氧合肌紅蛋白含量增加是因?yàn)槿庠陔缰七^程中，肌紅蛋白和亞硝酸鹽發(fā)生一系列的反應(yīng)生成亞硝基肌紅蛋白，使肉呈鮮紅色其含量增加；在11～12 h時(shí)，氧合肌紅蛋白含量減小而脫氧肌紅蛋白增加，這是因?yàn)槊荛]容器內(nèi)的氧分逐漸減少，使氧合肌紅蛋白脫氧轉(zhuǎn)化為脫氧肌紅蛋白[17]；相反，高鐵肌紅蛋白的含量呈先減小后增加的趨勢，在12 h達(dá)到最小值之后逐漸增大，其原因是腌制過程亞硝基肌紅蛋白并不穩(wěn)定，較長的腌制時(shí)間導(dǎo)致其被逐漸氧化成高鐵肌紅蛋白，使肉的表面逐漸變暗[18]。綜合比較3種肌紅蛋白相關(guān)量的趨勢，在腌制時(shí)間為12 h時(shí)，氧合肌紅蛋白含量最較高，腌制效果最好。因此選擇腌制時(shí)間11、12、13 h進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 負(fù)離子場強(qiáng)對腌肉中肌紅蛋白相關(guān)色素的影響

不同場強(qiáng)對腌肉中肌紅蛋白相關(guān)色素的影響如圖3所示。

圖3 不同場強(qiáng)對腌肉肌紅蛋白相關(guān)色素的影響Fig.3 Effect of different field strength on the amount of marinade myoglobin

由圖3可知，在負(fù)離子電場腌制條件下，脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白的含量隨著場強(qiáng)的增加先增加后減小，在3 kV時(shí)達(dá)到最大值，分別為34.328%、18.075%；高鐵肌紅蛋白含量隨著負(fù)離子電場強(qiáng)度的增加而呈先減小后增加趨勢，在3 kV時(shí)達(dá)到最小，脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白含量在3 kV后降低原因是過高的場強(qiáng)處理后加快氧合肌紅蛋白氧化成高鐵肌紅蛋白[19]。另外，亞鐵血紅素被代替或分離造成球蛋白分子部分變性，鐵原子的釋放使卟啉環(huán)被修飾(鐵原子的釋放可以促進(jìn)其氧化，而且與球蛋白的變性有關(guān)) 等都能造成肌肉顏色的改變[20]。綜合比較，場強(qiáng)為3 kV時(shí)，鮮紅色的氧合肌紅蛋白含量最高，且最不理想的褐色高鐵肌紅蛋白含量最低，所以選擇場強(qiáng)為1、3、5 kV進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 負(fù)離子電場腌制響應(yīng)面法優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響較大的因素，以腌制場強(qiáng)(A)、腌制時(shí)間(B)、腌制溫度(C)為自變量，以腌制后氧合肌紅蛋白作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)(表2)。

通過軟件Design-Expert分析，得到的關(guān)于負(fù)離子電場腌制對羊肉氧合肌紅蛋白的回歸方程如下：

Y=20.35+0.29A+0.18B+0.089C+0.055AB-2.500E-003AC-0.27BC-1.03A2-0.014B2+0.069C2

式中：A、B、C分別代表腌制場強(qiáng)、腌制時(shí)間和腌制溫度。通過Design-Expert分析，驗(yàn)證回歸模型及各參數(shù)的顯著度、失擬項(xiàng)結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 The design and results of response surface experiment

由表3響應(yīng)面的結(jié)果可知，模型的P=0.000 2(<0.01)，表明回歸模型達(dá)非常顯著水平，回歸方程失擬項(xiàng)P=0.380 3(>0.05)，失擬值差異不顯著，說明所選模型成立。回歸模型中一次項(xiàng)A、B、交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)A2影響極顯著。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為98.97%，說明模型相關(guān)度很好，實(shí)驗(yàn)誤差小。

表3 響應(yīng)面方差分析表Table 3 Analysis of variance table of regression equation

2.2.2 因素間的交互作用

經(jīng)Design-Expert軟件所得的響應(yīng)面曲線圖，如圖4～圖6所示。等高線可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著[21]。

圖4 場強(qiáng)與腌制時(shí)間對氧合肌紅蛋白含量 交互作用影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface and contour of the interaction between field strength and curing time on the content of oxygenated myoglobin

由圖4可知，場強(qiáng)與腌制時(shí)間對氧合肌紅蛋白含量交互作用顯著。當(dāng)腌制時(shí)間不變時(shí)，隨著負(fù)離子電場強(qiáng)度的增加，氧合肌紅蛋白含量呈先增加后減小的趨勢，因此，合適的場強(qiáng)有利于保持肉的顏色。

圖5 場強(qiáng)與腌制溫度對氧合肌紅蛋白含量 交互作用影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour of the interaction between field strength and curing temperature on the content of oxygenated myoglobint

由圖5可知，腌制溫度與場強(qiáng)對氧合肌紅蛋白的交互作用不顯著，當(dāng)腌制溫度不變時(shí)，隨著場強(qiáng)的增大氧合肌紅蛋白的含量呈先增加后減小的趨勢。

圖6 腌制時(shí)間與腌制溫度對氧合肌紅蛋白含量 交互作用影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour of the interaction between curing time and curing temperature on oxygenated myoglobin content

由圖6可知，腌制時(shí)間與腌制溫度間對氧合肌紅蛋白的交互作用極顯著，隨著腌制時(shí)間的增大及腌制溫度的提高，氧合肌紅蛋白的含量呈逐漸增加趨勢。只有場強(qiáng)、腌制時(shí)間及腌制溫度適宜，氧合肌紅蛋白的含量最佳，腌肉的顏色達(dá)到最理想。

2.2.3 工藝優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert分析優(yōu)化，得到負(fù)離子電場腌制的最優(yōu)工藝為場強(qiáng)3.34 kV，腌制時(shí)間13 h，腌制溫度4 ℃，氧合肌紅蛋白含量為20.79%。考慮到實(shí)際條件的局限性，將最優(yōu)工藝參數(shù)稍作調(diào)整為腌制場強(qiáng)3 kV、腌制時(shí)間13 h、腌制溫度4 ℃。利用更改后的工藝參數(shù)進(jìn)行腌制，相同條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，得到的氧合肌紅蛋白含量數(shù)據(jù)平均值為(20.67±0.18)%。與預(yù)測值20.79%基本相符，說明模型可以較好地預(yù)測負(fù)離子電場腌制后羊肉中氧合肌紅蛋白含量變化情況，具有實(shí)際參考價(jià)值。

3 結(jié)論

負(fù)離子電場腌制可以防止羊肉脂肪氧化，有效地保持肉的顏色。在腌制過程中，場強(qiáng)強(qiáng)度和腌制時(shí)間對羊肉氧合肌紅蛋白含量有顯著影響。根據(jù)Design Expert分析結(jié)果和實(shí)驗(yàn)得出最佳工藝條件為腌制場強(qiáng)3 kV、腌制時(shí)間13 h、腌制溫度4 ℃，在此條件下羊肉的氧合肌紅蛋白含量為20.67%，與預(yù)測值吻合。因此，優(yōu)化得到的負(fù)離子電場腌制工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際意義和參考價(jià)值。