腹腔注射納米氧化鋅的小鼠腸道菌群種類變化觀察

李巖,王群林,劉向勇,王偉,牛瑞

1山東大學第二醫院，濟南250033；2濱州醫學院藥學院；3濱州醫學院臨床學院

納米氧化鋅顆粒大小為1～100 nm，具有獨特的理化特性和良好的生物相容性,被廣泛應用于催化劑、食品、化妝品、抗微生物和抗真菌制劑[1,2]，并越來越多地應用于醫學領域[3,4]，但其安全問題仍是科學領域的研究熱點。納米氧化鋅具有抗微生物活性[5]，可通過多種復雜機制發揮作用[6]。多項研究[7,8]表明，胃腸道系統是納米氧化鋅的主要靶點。在人體中，腸道菌群種類、數量通常變化很小，但極易受到外部因素影響從而產生明顯改變。目前，納米氧化鋅對動物腸道菌群的影響國內外鮮有報道，2016年12月～2019年1月,本研究利用高通量測序技術觀察了納米氧化鋅腹腔注射后，大鼠腸道菌群分布、種類的變化。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 雄性昆明小鼠(8～10周齡，18～20 g)6只,購自煙臺綠葉生物有限公司。自由進食飲水，室溫25 ℃，光暗周期12 h/12 h，實驗前適應性飼養7 d。納米氧化鋅購自Sigma公司。基因組抽提試劑盒QIAamp DNA stool minikit購自Qiagen公司，QIAquick PCR purification kit試劑盒購自Qiagen公司。MiSeq測序儀購自Illumina 公司。

1.2 動物分組及納米氧化鋅腹腔注射 將昆明小鼠隨機分為對照組和實驗組，各3只。納米氧化鋅經4 RPS超聲處理15 min后懸浮在pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。實驗組小鼠每天腹腔內注射0.2 mL(0.5 g/kg體質量)納米氧化鋅溶液，對照組小鼠以相同頻率腹腔注射等體積的PBS，1次/d，均連續注射14 d，在藥物干預結束后3 d處死小鼠。

1.3 小鼠糞便樣本菌群DNA提取、擴增、測序 處死后截取小鼠結腸獲得糞便樣品，提取糞便樣本菌群基因組，并擴增16S V4區rDNA。退火溫度為50 ℃，延伸時間為30 s。PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min 1個循環、變性94 ℃ 30s 25個循環、退火50 ℃ 30 s 25個循環、延伸72 ℃ 30 s 25個循環，于4 ℃保存。從1%瓊脂糖凝膠中取出PCR產物，并純化。對原始數據進行質量控制，截斷或舍棄低質量序列，連接優質序列(連續相同堿基<6；模糊核苷酸N <1)，通過Illumina 公司的MiSeq測序儀對優質序列組成的DNA文庫進行上機測序。

根據優質序列的相似度，將16S V4區rDNA擴增產物的序列歸為多個操作分類單元(OTU),通過尋找最近祖先方法，得到每個OTU的分類學信息,對OTU列表中獲得的分類信息與豐度信息進行整理，從門、屬水平分別繪制出菌群分布餅圖。進一步進行物種豐度差異分析(對同分類的OTU進行聚類，對每個樣品物種豐度進行標準化處理。先進行F檢驗，P<0.05的OTU采用異方差t檢驗，P>0.05采用同方差t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義)。同時進行Alpha多樣性(應用mothur軟件計算出生物多樣性指數，以此為標準進行分析判定)、Beta多樣性分析(對實驗組與對照組樣本聚類得到的文庫進行主坐標分析PCoA，計算出Unifrac距離矩陣，獲得二維數據，繪制應用加權的UniFrac PCoA散點圖，樣本群落組成越相似，則在圖中的距離越接近，群落差異很大的樣本則會遠遠分開)。生物多樣性相關指數，主要有以下3種：豐富度指數：Chao1/ACE指數；覆蓋率指數：good′s coverage；多樣性指數： Shannon指數。Chao1/ACE指數越低，shannon指數越低，表示群落多樣性越少、結構越不穩定、不均一性越高。

2 結果

6個糞便樣本中總共獲得腸道菌群71 715個V4 16S rDNA有效序列，其中優質序列70 977個，多分布于225 bp附近。共分析出17門、26綱、42目、64科、115屬。實驗組含有OTU 2 936個、對照組含有OTU 2 981個；兩組共同具有OTU 984個，所占百分比為19.95%； 兩組OTU總共有4 933個。兩組都在門水平檢測出17種，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、柔膜菌門、TM7菌門、脫鐵桿菌門、放線菌門、藍藻菌門、疣微菌門、螺旋菌門、廣古菌門、綠菌門、梭菌門、黏膠球形菌門、產水菌門、異常球菌-棲熱菌門、浮霉菌門。實驗組厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、柔膜菌門所占百分比分別為39%、33%、25%、3%，對照組分別為68%、19%、11%、1%。實驗組小鼠腸道幽門螺桿菌屬、顫桿菌屬、另枝菌屬所占百分比分別為46%、5%、22%，對照組分別為21%、15%、35% 物種豐度差異性分析顯示：門水平：對照組多于實驗組2倍差異的門類有廣古菌門、綠菌門、螺旋菌門、TM7 菌門；實驗組多于對照組2倍差異的門類有變形桿菌門、異常球菌-棲熱桿菌門、脫鐵桿菌門、疣微菌門、浮霉菌門、柔膜菌門；與對照組相比，實驗組中異常球菌-棲熱桿菌門增多(P=0.042)。屬水平：對照組多于實驗組2倍差異的屬有17個，包括厭氧桿菌、布魯菌、埃希菌等；實驗組多于對照組2倍差異的屬有48個，包括不動桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、幽門螺桿菌等；一部分菌屬目前研究較少，甚至尚無明確的中文名稱；與對照組相比，實驗組臭味菌屬(P=0.038)、顫桿菌屬(P=0.034)減少，而擬桿菌屬增多(P=0.023)。

Alpha多樣性分析結果：實驗組生物多樣性指數Chao、ace、Shannon、coverage分別為4 783.9、9 612.2、4.69、0.912，對照組分別為5 281.4、11 220.4、5.24、0.892。實驗組多樣性指數包括Chao1/ACE指數及Shannon指數均低于對照組，覆蓋率指數兩者均在0.89以上，說明所構建文庫的庫容足夠大，可代表所研究動物腸道菌群中絕大多數細菌。Beta多樣性分析結果:PC1變化率65.97%，提示氧化鋅納米對實驗組菌群影響的貢獻率為65.97%，PC2變化率17.30%，提示其他某種因素對兩組菌群影響的貢獻率為17.30%。

3 討論

納米氧化鋅材料被廣泛應用于醫學領域，研究[9]表明用作藥物的納米氧化鋅可通過胃腸道吸收到體內，損害腸上皮細胞，破壞腸屏障，揭示了細菌易位的可能性。一方面，納米粒子作為載體能將抗微生物劑靶向送至感染部位，提高感染部位藥物濃度使其發揮更好的抗菌活性[10]，另一方面，多個研究[11，12]揭示了納米氧化鋅本身對多種細菌可產生毒性作用，如大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌等。鑒于納米氧化鋅材料愈加廣泛應用于醫學領域，尤其對微生物的多重作用，我們有必要研究納米氧化鋅干預對生物體腸道菌群有何影響，為促進或者限制其臨床應用提供實驗依據。

國內外研究[13，14]報道了納米氧化鋅對藻類、甲殼類動物、脊椎動物等具有急性毒性作用，也有研究揭示其神經毒性、發育毒性、遺傳毒，而對小鼠腸道菌群有無影響尚無報道。高通量測序技術可揭示微生物群落多樣性、種群結構，近年來利用此技術研究生命體、疾病與腸道菌群的關系有了很大進展。本研究中，我們利用高通量測序技術觀察小鼠糞便微生物群落特征，并發現實驗組和對照組在菌群分布、結構上的顯著差異：實驗組和對照組分別存在2 936和2 981個OTU，共享OTU的百分比為19.95 %。兩組在門、屬水平微生物分布均不同，各種微生物占比也有差異，提示納米氧化鋅可能會影響菌群分布、結構；菌群豐度差異分析發現，實驗組中異常球菌-棲熱菌門增多，擬桿菌屬增多，臭味桿菌屬和顫桿菌屬較對照組減少，說明兩組菌群分布、結構的差異，這可能是納米氧化鋅影響的結果，但這些變化是納米氧化鋅破壞腸屏障導致細菌易位抑或納米氧化鋅本身抑菌活性的結果，還是兩者均對腸道菌群改變產生一定影響，尚需進一步研究證實。我們發現差異性菌群主要為國內外研究較少的菌種，提示對這些相對陌生菌屬進行深入研究很有必要。

通過對小鼠糞便菌群的測序分析，我們發現實驗組和對照組在菌群種類多樣性上亦存在顯著差異。Alpha多樣性通常指一個特定生態系統內的多樣性，可反映豐富度和均勻度，一方面與種類數目即豐富度有關，另一方面與多樣性有關，提示整個群落中個體分配上的均勻性。Beta多樣性分析是不同生態系統之間多樣性的比較，揭示群落組成變化、分化的程度，與環境的復雜梯度或環境的模式有關，用變化率表示，以此判定物種對環境異質性的反應，并指示各樣本的相似性。本研究中Alpha多樣性分析示，與對照組比較，實驗組生物多樣性指數均下降，提示納米氧化鋅組腸道菌群多樣性減少且不均一性增加；Beta多樣性分析提示納米氧化鋅對實驗組菌群影響較大(貢獻率約占65.97%)，且與對照組樣本文庫相對獨立，對照組樣本個體相似性相對較高，而實驗組樣本個體對環境異質性反應差異較大。

綜上所述，氧化鋅納米腹腔注射后, 小鼠腸道菌群多樣性減少,不均一性增加。我們首次利用高通量測序技術初步觀察了氧化鋅納米腹腔注射后小鼠腸道菌群分布及種類的變化，填補了納米氧化鋅暴露對腸道菌群影響研究的空白。 本研究篩選的具有統計學差異的菌群是否通過各自的生物學特性顯著影響機體某方面功能仍需明確，是我們下一步研究重點。