前列腺素E2受體拮抗劑對(duì)肝癌細(xì)胞增殖遷移及EP4R/Snail 和EP4R/c-myc表達(dá)的影響觀察

陸玉，宋莎莎，章禮久

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥230601

肝癌是世界上最惡性的腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第3大原因[1]。盡管手術(shù)和藥物治療有所改善，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致肝癌患者的預(yù)后較差[2]。肝癌的發(fā)生是一個(gè)多細(xì)胞、多分子、多基因的復(fù)雜過(guò)程。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些分子通路參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展、血管生成和轉(zhuǎn)移。前列腺素E2(PGE2)是由環(huán)氧合酶-2 (COX-2)和前列腺素E合酶產(chǎn)生的花生四烯酸代謝物[3]。研究[4，5]表明，PGE2通過(guò)與不同前列腺素E(EP)受體亞型結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞入侵和遷移，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)腫瘤血管生成，參與乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和其他癌癥的發(fā)展。PGE2通過(guò)介導(dǎo)四種亞型(EP1～4)的EP受體發(fā)揮多種生物學(xué)作用，其中EP4受體(EP4R)與多種人類癌細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)[6，7]。

Snail是近年發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)影響細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[8]。此外，肝癌的發(fā)生發(fā)展也與原癌基因的激活或過(guò)表達(dá)有關(guān)[9]。c-myc原癌基因是禽骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因(v-myc)的人類細(xì)胞同源物，它編碼轉(zhuǎn)錄因子c-myc蛋白，上調(diào)許多靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。PGE2/EP4R信號(hào)通路在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)c-myc和Snail是腫瘤微環(huán)境環(huán)節(jié)中的重要調(diào)節(jié)因子，他們之間可能存在相互作用，但目前其之間的相互關(guān)系在肝癌中的報(bào)道少見(jiàn)。2017年10月～2019年5月，本研究觀察了前列腺素E2受體拮抗劑CJ-42794對(duì)肝癌細(xì)胞增殖遷移及Snail和c-myc表達(dá)的影響，以探討PGE2/EP4R信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞增殖、遷移中的作用及與c-myc、Snail之間的相互關(guān)系，為肝癌的臨床診治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 HepG2和Huh7細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)。細(xì)胞在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM和1%青霉素/鏈霉素的完整培養(yǎng)基(高糖)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基溫度為37 ℃，加5% CO2的濕化培養(yǎng)箱。 PGE2和EP4R選擇性拮抗劑(CJ-42794)購(gòu)自德國(guó) MCM公司，DMEM、血清、胰酶均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司，EP4 單克隆抗體購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司，c-myc和Snail一抗購(gòu)自美國(guó) Affinity 公司，山羊抗兔和山羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó) Affinity 公司。

1.2 細(xì)胞分組及藥物處理 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HepG2和Hum7細(xì)胞，常規(guī)消化后，以含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL。將HepG2和Hum7細(xì)胞分別分為對(duì)照組、PGE2組、觀察組。以每孔100 μL(3×103個(gè))細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(重復(fù)3塊)，每組6個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2條件下過(guò)夜。更換培養(yǎng)基，對(duì)照組加入相同體積溶媒,PGE2組分別加1、2、5 μmol/L 的PGE2(A，B，C組)，觀察組加入5 μmol/L的 PGE2 +5 μmol/L的 cj-42794 ，37 ℃，5% CO2條件下分別培養(yǎng)24 h和48 h。

1.3 各組細(xì)胞增殖、遷移能力觀察 細(xì)胞增殖能力：采用MTT法。各組加藥培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL的0.5% MTT溶液(終濃度0.5 mg/mL)，繼續(xù)37 ℃，5% CO2條件下孵育4 h。4 h后吸取96孔板中的混合液，再添加150 μL異丙醇，振蕩10 min。將96孔板置于酶標(biāo)儀中，于570 nm (630 nm作為參考)處測(cè)各孔吸光度值(OD值) ，計(jì)算細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞相對(duì)增殖率 = 實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值 × 100%。細(xì)胞遷移能力：采用Transwell法。取130 μL DMEM滴于上室內(nèi)使膜親水。取各組處理24 h后的HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞常規(guī)消化離心，用1 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取2×104個(gè)細(xì)胞加入600 μL 含30% FBS DMEM 培養(yǎng)液，即每組最后的細(xì)胞數(shù)相同。吸去上室內(nèi)無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，將含有2×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液混勻，緩慢逐滴垂直加入小室中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，期間動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞穿膜情況。約48 h后取出小室，吸去下室內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加800 μL 4%多聚甲醇固定30 min，于雙蒸水清洗后置于空氣中自然干燥, 結(jié)晶紫染液染色25 min，再于雙蒸水中清洗3次, 并用棉球擦去表面細(xì)胞。在倒置相差顯微鏡 (100倍) 上取上下左右中5個(gè)視野拍片計(jì)數(shù)，計(jì)算5個(gè)視野的平均值作為穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.4 各組Snail和c-myc的檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞加藥處理24 h后，收集細(xì)胞采用 RIPA 裂解液提取蛋白，4 ℃裂解30 min,13 200 r/min離心25 min，得到上清液。然后用 BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。采用 10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，將PVDF膜放于5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h ,隨后添加一抗(c-myc 1∶1 000；Snail 1∶1 000)和小鼠單克隆anti-β-actin(1∶500) 4 ℃ 過(guò)夜孵育，然后將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h, ECL 顯色,以 β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析圖像，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 兩種細(xì)胞中各組細(xì)胞增殖率、遷移細(xì)胞數(shù)比較 HepG2細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h時(shí)：觀察組、A組、B組、C組、對(duì)照組細(xì)胞增殖率分別為0.14±0.01、0.11±0.01、0.13±0.02、0.16±0.01、0.10±0.01；培養(yǎng)48 h時(shí)分別為0.10±0.01、0.10±0.00、0.11±0.01、0.13±0.02、0.10±0.00。培養(yǎng)24 h時(shí)，與對(duì)照組比較，B、C組和觀察組的細(xì)胞增殖率升高，且C組升高最顯著(P均<0.05);與B組比較，觀察組細(xì)胞增殖率降低(P>0.05)。培養(yǎng)48 h時(shí)，與對(duì)照組比較，B、C組細(xì)胞增殖率升高，且C組升高最顯著(P均<0.05);分別與B、C組比較，觀察組的細(xì)胞增殖率降低(P均<0.05)。Huh7細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h時(shí),觀察組、A組、B組、C組、對(duì)照組細(xì)胞增殖率分別為0.14±0.00、0.11±0.01、0.15±0.02、0.19±0.04、0.10±0.00；培養(yǎng)48 h時(shí),分別為0.09±0.01、0.11±0.01、0.11±0.00、0.12±0.02、0.10±0.01。培養(yǎng)24 h，與對(duì)照組比較，B、C組和觀察組的細(xì)胞增殖率升高，C組升高最顯著(P均<0.05);與C組比較，觀察組細(xì)胞增殖率低(P<0.05)。培養(yǎng)48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，C組的細(xì)胞增殖率升高(P<0.05);與B、C組比較，觀察組的細(xì)胞增殖率降低(P<0.05)。

HepG2細(xì)胞中，觀察組、A組、B組、C組及對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(460±12)、(233±9)、(635±37)、(667±27)、(100±6)個(gè)/HP。與對(duì)照組比較，PGE2各刺激組的遷移細(xì)胞數(shù)均增多(P均<0.05);與B、C組比較，觀察組的細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)低(P均<0.05)。Huh7細(xì)胞中，觀察組、A組、B組、C組及對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(108±2)、(99±2)、(144±2)、(189±5)、(100±2)個(gè)/HP。與對(duì)照組比較，B、C組的遷移細(xì)胞數(shù)增多(P均<0.05);與B、C組比較，觀察組的遷移細(xì)胞數(shù)減少(P均<0.05)。

2.2 兩種細(xì)胞中各組c-myc、Snail蛋白表達(dá)比較 HepG2細(xì)胞中，觀察組、A組、B組、C組、對(duì)照組細(xì)胞c-myc蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.58±0.02、0.60±0.01、0.95±0.01、0.76±0.02、0.56±0.00，Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.34±0.01、0.47±0.00、0.63±0.01、0.78±0.02 、0.20±0.00。Huh7細(xì)胞中，觀察組、A組、B組、C組、對(duì)照組細(xì)胞c-myc蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.51±0.03、0.52±0.02、0.61±0.00、0.66±0.01、0.42±0.00，Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.48±0.01、0.56±0.01、0.59±0.01、0.70±0.02、0.42±0.01。

兩種細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，PGE2 組c-myc、Snail蛋白表達(dá)水平均升高(P均<0.05)。與 PGE2 組比較，觀察組c-myc、Snail 蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P均<0.05)。

3 討論

目前，原發(fā)性肝癌的治療方法較多，主要有手術(shù)治療、局部消融、經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、放射治療、藥物治療和免疫療法等[10]。雖然單個(gè)治療方法效果不太理想，多個(gè)治療方案的聯(lián)合應(yīng)用可以有效延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，然而，肝癌的治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，主要是因?yàn)榇蠖鄶?shù)被診斷出肝癌的患者已處于晚期階段，治療方法上存在局限性，此外，治療后患者的5年生存率仍然較低，僅為10%左右。因此有必要深入研究肝癌致病原因及發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制，為肝癌的致病病因、治療方法及預(yù)后等過(guò)程提供新的發(fā)現(xiàn)與思路。

COX-2和PGE2在許多癌組織中表達(dá)上調(diào)，參與腫瘤的遷移和進(jìn)展[11，12]。PGE2 通過(guò)結(jié)合EP受體發(fā)揮多種生物學(xué)作用，目前，EP受體包括EP1、EP2、EP3和EP4四個(gè)亞型。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族，與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)[13]。GPCRs是包含7個(gè)跨膜螺旋區(qū)的一個(gè)超家族，結(jié)合廣泛的配體，包括Gα亞基和Gβγ-二聚體。Gα亞單位具有內(nèi)源性GTPase，對(duì)Gβγ二聚體的功能知之甚少，兩者都通過(guò)多種效應(yīng)分子啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14]。EP1受體與Gαq偶聯(lián)，與蛋白激酶C(PKC)激活相關(guān)，而EP2受體與Gαs和蛋白激酶A(PKA)/腺苷酸環(huán)化酶(AC)相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸單磷酸(cAMP)的升高。EP3受體有多個(gè)剪接變體，能夠與不同的G蛋白偶聯(lián)，從而促進(jìn)EP3作用的廣泛性。EP4R通過(guò)與Gαs和PKA相結(jié)合來(lái)增加細(xì)胞cAMP[15]。EP4R對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移具有重要的作用。在結(jié)腸癌中，活化的EP4R通過(guò)mTORC1信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和VEGF生成。EP4R還可通過(guò)形成EP4/β-arrestin/c-Src/EGFR信號(hào)復(fù)合物，激活下游PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)移。腫瘤中，EP4R也是被研究的最為廣泛和深入的EP受體亞型。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者腫瘤組織中PGE2及其受體(尤其是EP4)的表達(dá)水平高于正常組織[14]。為進(jìn)一步驗(yàn)證 EP4R在 PGE2 介導(dǎo)肝癌中的作用，我們采用 EP4R選擇性拮抗劑 CJ-42794。結(jié)果顯示，EP4R選擇性拮抗劑CJ-42794 顯著抑制了 PGE2 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，影響肝癌細(xì)胞的凋亡。提示，EP4R在 PGE2 介導(dǎo)肝癌中具有重要作用。

肝癌最重要的特征是快速?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這與EMT和Snail的上調(diào)有關(guān)[16,17]。PGE2作為COX-2的主要產(chǎn)物在前列腺癌小鼠模型中上調(diào)了Snail的表達(dá)，促進(jìn)了EMT的表達(dá)[18]；然而，在肝癌細(xì)胞中，PGE2對(duì)Snail的調(diào)節(jié)作用尚不明確。本研究我們采用Western blotting 法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中 Snail 的表達(dá)情況，試圖探索 PGE2 是否可能通過(guò) EP4R/Snail 通路調(diào)節(jié)肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，促進(jìn)肝癌的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞中 Snail 的蛋白表達(dá)水平顯著升高。此外，EP4R選擇性拮抗劑對(duì)肝癌細(xì)胞的 Snail 表達(dá)具有一定影響，提示PGE2 通過(guò)EP4R/Snail通路介導(dǎo)肝癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等，參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

c-myc 是一種多功能的早期反應(yīng)基因，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程。研究表明 c-myc 在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，影響腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。基于以上基礎(chǔ)和課題組前期研究基礎(chǔ)，本研究我們采用 Western blotting 法檢測(cè)肝癌細(xì)胞 c-myc 。結(jié)果顯示，c-myc 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著升高。此外，EP4R選擇性拮抗劑對(duì)肝癌細(xì)胞的 c-myc 表達(dá)具有一定影響，提示 PGE2 可能通過(guò) EP4R/c-myc 通路介導(dǎo)肝癌的發(fā)生與發(fā)展。因此，研究Snail和c-myc在肝癌中活化的分子機(jī)制至關(guān)重要。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PGE2通過(guò)EP4R/Snail 或EP4R/c-myc通路加速了腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。

綜上所述，前列腺素E2受體拮抗劑CJ-42794可抑制肝癌細(xì)胞的增殖遷移，并抑制EP4R/c-myc和EP4R/Snail的表達(dá)，提示PGE2可能通過(guò)EP4R介導(dǎo)的c-myc和(或)Snail信號(hào)來(lái)影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而參與調(diào)節(jié)肝癌的發(fā)生與發(fā)展，具體通過(guò)何種機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。