外泌體在糖尿病神經病變中的作用及應用研究進展

趙炳佳，梁曉春

中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院，北京100730

國際糖尿病聯盟最新流行病學數據表明，2019年全球糖尿病患者達4.63億，我國患者最多，高達1.164億[1]。糖尿病一系列并發癥中以神經病變最為常見，至少50%的患者最終會罹患糖尿病神經病變，其致殘率和病死率均較高[2]。目前，研究人員從晚期糖基化終產物、多元醇通路、蛋白激酶C通路、氧化應激、自噬等方面對糖尿病神經病變的病理機制進行了大量研究，但臨床治療效果并不理想[3]。近年來，越來越多的研究表明，外泌體有望成為糖尿病神經病變診治研究的新方向。外泌體是一種納米級細胞外囊泡，直徑30～150 nm，具有脂質雙分子層外膜結構，攜帶著豐富的核酸、蛋白質、脂質等物質，廣泛存在于各種組織、血清、尿液中[4～6]。外泌體信號傳遞不同于其他經典的細胞間信號通訊方式。在高糖病理狀態下，神經元及其膠質細胞外泌體的合成、釋放和轉運會發生質和量的變化，從而影響靶細胞的生長和發育[7]。現就外泌體在糖尿病神經病變中的作用及應用研究進展綜述如下。

1 外泌體參與糖尿病神經病變進程的分子基礎

外泌體是由胞膜內吞形成管腔囊泡，經過內吞體分選轉運復合體和神經酰胺相互作用后包裹脂質、蛋白質、核酸等“貨物”形成多囊泡體，最后與胞膜融合并向外釋放的囊泡小體[5,8]。合成的外泌體能夠通過血液、組織液等方式進入到全身各個組織細胞中，釋放出內容物，傳遞來源細胞的信號，調節靶細胞相應的生理活動。糖尿病來源的外泌體本身攜帶致病信息，游走在心肌、內皮等組織中則會造成不同程度的病變[9]。有研究證實，外泌體能夠透過血腦屏障進到腦組織中[10]。這表明糖尿病來源的外泌體也很有可能由此進入到中樞神經系統中，造成進一步代謝損傷。

多項研究顯示，外泌體中的脂質分子數量和種類豐富，含有鞘磷脂、磷脂酰膽堿、神經酰胺、神經節苷脂等，并有著豐富的生理功能[11]。如神經節苷脂能夠調節神經的生長發育，研究證實其能改善糖尿病周圍神經病患者的癥狀[12]。同時，外泌體為雙層膜結構，對其在血液和神經組織中的流動和轉運具有重要意義。研究表明，外泌體膜外的鞘磷脂和神經節苷脂含量比值對外泌體的流動性有顯著影響[13]。這對進一步研究外泌體在全身各組織的轉移能力和流動性非常有意義。

外泌體普遍含有跨膜蛋白、GPI錨蛋白、熱休克蛋白等。不同組織細胞來源的外泌體有著特異性的膜蛋白，如神經元外泌體中含有乙酰膽堿酯酶或β淀粉樣蛋白等。這種特異性膜蛋白可作為鑒別和純化神經元來源外泌體的陽性標志物，而且，外泌體攜帶的功能性蛋白質能夠進入不同組織中發揮作用。如有些外泌體中攜帶細胞因子、生長因子、纖維連接蛋白、膠原等，而這些蛋白與糖尿病狀態下神經元及膠質細胞的炎癥反應、修復、再生以及微環境的形成密切相關[5]。

除了豐富的脂質和蛋白質分子，外泌體中還存在著數量可觀又復雜的核酸分子，在細胞間信息傳遞和調節中發揮著重要功能[14]。Krishnan等[15]通過對糖尿病患者胰島組織來源的外泌體中所有RNA進行高通量測序分析，發現一共有72條RNA(包括mRNA、miRNA、piRNA、IncRNA、snoRNA、tRNA)表達水平具有統計學差異，并且通過生物信息學分析發現，這些RNA與胰島素分泌、鈣離子信號通路及細胞凋亡等密切關聯，但具體分子機制有待進一步闡明。還有研究表明，病理狀態下的RNAs亦能夠通過外泌體轉運到神經組織細胞中，如神經元、雪旺細胞等，在其中釋放后影響細胞中的基因表達和蛋白合成[4]。

2 外泌體在糖尿病神經病變中的調節作用

在神經系統中，外泌體可來源于神經干細胞、神經元、少突膠質細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞以及雪旺細胞[16]。高糖狀態容易造成神經軸突萎縮、神經纖維功能喪失、髓鞘脫落、神經元凋亡等，病理細胞來源的外泌體則會導致病變程度進一步惡化。這表明在糖尿病神經病變中，外泌體可能參與了病理活動的進程。

2.1 外泌體在中樞神經系統中的調節作用 研究發現，營養神經元的外周細胞外泌體攜帶蛋白質、核酸等物質進入神經元后提高了神經的再生能力、氧化應激能力，起到修復高糖代謝損傷神經元、促進神經認知功能恢復的良性調節作用。如Venkat等[17]發現小鼠腦內皮細胞來源的外泌體能夠在腦缺血區域通過增加神經軸突、血管密度及上調miRNA-126誘導巨噬細胞聚集等發揮作用，促進2型糖尿病中風小鼠神經修復，顯著改善認知功能。而且，外泌體還具有調節神經元抗氧化應激的能力。Frohlich等[18]發現，少突膠質細胞外泌體能夠攜帶具有抗氧化應激能力的超氧化物歧化酶和過氧化物歧化酶進入神經元。隨著抗氧化應激能力的增強，神經元能夠維持細胞內穩態，減少凋亡，發揮正常的神經功能。

2.2 外泌體在周圍神經系統中的調節作用 目前關于雪旺細胞外泌體與神經元之間相互作用的眾多研究發現，健康細胞來源的外泌體能夠調節病理神經細胞狀態，促進其恢復正常生理功能；相反，高糖病理狀態下的雪旺細胞來源外泌體則會對神經元造成損傷，導致病情惡化。Zhou等[19]發現，來自RSC96雪旺細胞的外泌體對受到機械損傷的背根神經元細胞具有促進增殖、延緩衰老、抑制凋亡的作用。Simeoli等[20]進一步研究發現，當背根神經元受到損傷時，其miRNA表達失調，并且釋放出miR-21-5p表達上調的外泌體，該外泌體能夠募集巨噬細胞，進一步誘發炎癥反應，修復受損神經元。但是，有學者發現，把高糖狀態下生長的雪旺細胞來源外泌體注射進小鼠坐骨神經后，會加重糖尿病小鼠的周圍神經病變程度。隨后，該研究發現，與正常雪旺細胞外泌體對比，高糖狀態下生長的雪旺細胞來源外泌體中miR-28、31a、130a高表達；在培養背根神經元時加入該外泌體后發現，其神經軸突生長受到抑制，并且軸突中相應的靶蛋白如DNA甲基轉移酶3a、內吞銜接蛋白、突觸小體相關蛋白25、生長相關蛋白43表達均下降。后續實驗中，研究者發現，轉染了miR-28、31a、130a的背根神經元生長受到抑制，這進一步證實了高糖狀態下雪旺細胞外泌體及其表達的miRNA均加重了糖尿病周圍神經病變過程[21]。

3 外泌體在糖尿病神經病變治療中的應用探索

多項研究發現，糖尿病神經病變與炎癥反應、氧化應激、脫髓鞘、突觸可塑性損傷、神經萎縮等密切相關，而目前研究證實外泌體具有加強抗炎、抗氧化應激、促進髓鞘再生、突觸重塑、神經再生和修復等作用，這表明外泌體能夠調節神經元的生長與發育，對糖尿病神經病變具有潛在的治療效果。

3.1 外泌體減輕炎癥反應 在抗炎作用方面，有研究證實，來自骨髓間充質干細胞的外泌體可通過抑制促炎基因表達等治療糖尿病小鼠神經病變，促進其神經功能恢復。Kubota等[22]發現，大鼠骨髓間質干細胞來源外泌體攜帶的miRNA-146a能夠預防糖尿病引起的海馬神經元與星形膠質細胞損傷，最終促進神經認知功能的恢復，而其具體機制則與抗炎作用有關。進一步地，Fan等[23]將小鼠骨髓間充質干細胞來源外泌體注射入糖尿病周圍神經病變小鼠模型，結果顯示，小鼠熱痛閾值、感覺和運動神經傳導速度等周圍神經功能明顯改善；研究人員通過高通量測序發現，該外泌體中高度表達Let-7a、miR-17、miR-23等，而這些miRNA與Toll樣受體(TLR)4/NF-κB信號通路密切相關，并且通過Western blotting實驗證實了注射該外泌體的糖尿病小鼠相比對照組，其坐骨神經中TLR4、IRAK1、NF-κB p65的表達明顯降低。

3.2 外泌體抗氧化應激 研究表明，干細胞外泌體增強了高糖下神經元的抗氧化應激能力，而且神經元自身的外泌體能夠將細胞內的過氧化物轉移出細胞，減輕了對神經元的氧化損傷。Nakano等[24]發現，大鼠骨髓間質干細胞來源外泌體具有抗氧化應激能力，能夠增加神經元突觸生長密度，改善糖尿病誘發的神經細胞超微結構異常，從而修復受損的神經元和星形膠質細胞，減輕糖尿病大鼠的神經認知功能障礙。另外，還有研究者證實，外泌體能夠將來源細胞損壞的染色體DNA片段運出細胞外，減輕細胞內氧化應激反應和DNA損傷，維持細胞內穩態[25]。這一點，對于減輕高糖狀態下的神經元及其膠質細胞的氧化應激引起的DNA損傷尤其重要。

3.3 外泌體促進神經修復 無論是神經元還是干細胞來源的外泌體都攜帶著大量保護神經和營養神經的蛋白質和核酸，可調節相關分子通路，起到保護髓鞘、重塑突觸、修復受損神經元等作用，促進神經元的生長與功能恢復，展示了潛在的治療前景。

在髓鞘保護方面，有研究發現，少突膠質細胞外泌體中攜帶大量的髓磷蛋白磷脂蛋白、2030-環核苷酸-磷酸二酯酶、髓鞘堿性蛋白等，而這些成分有利于形成神經髓鞘，包裹神經，形成保護作用和營養支持[26]。Pusic等[27]將提取自健康大鼠血清的外泌體加入大鼠海馬神經組織中一起培養，結果顯示該外泌體能促進海馬中髓磷脂的表達、促進少突膠質前體細胞和神經干細胞的生長，且該外泌體富含miR-219。miR-219能夠明顯促進髓鞘再生，保護軸突，改善脫髓鞘病變，促進神經功能恢復[28]。

在突觸重塑方面，去極化神經元釋放出的外泌體中富含突觸可塑性微管相關蛋白1B及其miRNA，而這對于神經突觸重塑非常有意義[29,30]。同時，Xin等[31]發現，來自多功能性間充質基質細胞的外泌體能夠介導miR-133b轉移至星形膠質細胞和神經元，從而調節基因表達，有益于神經突觸的重塑和功能恢復。另一方面，有學者證明，來自小鼠小膠質細胞的外泌體能夠選擇性清除PC12神經細胞的病理性突觸連接，保證正常的神經突觸功能[32]。

在神經生長方面，有學者發現，在體外環境下間充質基質細胞來源外泌體能夠促進皮層神經元軸突的生長和延長，而減少外泌體中RNA誘導沉默蛋白Ago2表達后，神經軸突的生長則受到抑制；增加外泌體中miR-17-92表達后，其對神經的促生長作用更強，該miRNA可能通過PTEN/mTOR信號轉導通路發揮作用[33]。另外，還有學者分別提取1型糖尿病大鼠骨髓基質細胞和正常大鼠骨髓基質細胞來源的外泌體，并分別注射進1型糖尿病腦卒中大鼠顱腦中，發現前者具有重塑腦血管和腦白質的作用，檢測結果顯示前者血清miR-145表達下降，而miR-145靶基因腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白1和胰島素樣生長因子1受體的表達上升。研究進一步證實，轉染和敲除miR-145的外泌體影響了神經的生長程度，表明miR-145在神經保護中起到重要調節作用[34]。而在外周神經系統方面，有學者發現雪旺細胞來源的外泌體能夠促進神經軸突再生，修復坐骨神經元損傷[35]。

綜上所述，外泌體在糖尿病神經病變中介導多種信號通路，在各個細胞間傳遞著不同訊息，調節著病理活動、生理功能。無論是髓鞘退化或形成，還是神經細胞的凋亡和再生，外泌體均扮演著至關重要的作用。由于不同生理或病理狀態下，外泌體及其內容物會發生相應的差異性改變，若在其中尋找到生物標志物，體液外泌體檢測或將成為糖尿病神經病變早期有效的診療手段。而且，外泌體為自身分泌，能夠游走全身甚至透過血腦屏障，若將相應藥物等包裹進外泌體，再被細胞靶向吸收，將會成為精準治療的有效手段。然而，外泌體的具體調節機制如高糖狀態如何影響外泌體的形成與傳播等仍有待進一步研究探索。