糖尿病腎病中表達(dá)上調(diào)miRNA在腎臟內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

袁蕓，胡瓊英

1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都611137；2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

糖尿病腎病(DKD)是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，是糖尿病微血管并發(fā)癥和終末期腎臟疾病的主要病因[1]。在多種致病因素單獨(dú)或協(xié)同作用下，DKD患者的腎組織將會(huì)發(fā)生一系列病理性改變，包括腎小球基底膜增厚、足突融合、足細(xì)胞丟失、系膜基質(zhì)擴(kuò)張及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積等，最終導(dǎo)致終末期腎臟疾病[2]。內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)是內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞因子刺激下，失去固有表型逐漸轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)樣細(xì)胞的過(guò)程，在各種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用[3]。有學(xué)者在經(jīng)典腎纖維化模型中研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞可由內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)[4]。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，除了原本駐留的成纖維細(xì)胞外，內(nèi)皮細(xì)胞也可成為其潛在前體，僅僅阻斷成纖維細(xì)胞活化不足以阻止腎纖維化的進(jìn)展，如何控制內(nèi)皮細(xì)胞的這種特殊轉(zhuǎn)化也至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)是一種廣泛分布、長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，成熟的單鏈miRNA結(jié)合mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，從而誘導(dǎo)mRNA降解或抑制蛋白翻譯[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)差異性表達(dá)的miRNA參與心臟、腎、肝、肺等器官纖維化，通過(guò)抑制或促進(jìn)各種基因和蛋白的活性，影響EndMT誘導(dǎo)的纖維化[6]。miRNA對(duì)DKD和腎纖維化的調(diào)控是多途徑的。本文現(xiàn)就糖尿病腎病中表達(dá)上調(diào)的miRNA在腎臟EndMT中的調(diào)控機(jī)制相關(guān)研究作一綜述，以期加深對(duì)DKD腎纖維化發(fā)病機(jī)制的了解，為其診斷和靶向治療提供新的生物標(biāo)志物。

1 miR-21

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，miR-21是miRNA家族中表達(dá)最高的成員之一。Assmann等[7]對(duì)58例1型糖尿病患者(含23例對(duì)照組患者，18例中度DKD患者和17例重度DKD患者)的血漿進(jìn)行miRNA表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)miR-21-3p在大量蛋白尿DKD患者血漿中表達(dá)明顯升高。

同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)是一種腫瘤抑制因子，可使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)去磷酸化，抑制蛋白激酶B(Akt)的磷酸化活性。Kumarswamy等[8]在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到miR-21高表達(dá)及Akt信號(hào)通路激活；過(guò)表達(dá)miR-21可模擬TGF-β的介導(dǎo)作用，降低內(nèi)皮標(biāo)志物血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-Cadherin)的表達(dá)，增加間充質(zhì)標(biāo)志物成纖維細(xì)胞特殊蛋白的表達(dá)。該研究表明miR-21可通過(guò)沉默內(nèi)皮細(xì)胞中的PTEN，以激活A(yù)kt介導(dǎo)的EndMT。另外，有報(bào)道指出TGF超家族骨成型蛋白7(BMP-7)通過(guò)下調(diào)miR-21發(fā)揮其對(duì)DKD纖維化的抑制作用[9]。因此，推測(cè)miR-21參與的TGF-β/BMP-7/miR-21/PTEN纖維化調(diào)控通路可能為控制DKD中EndMT的有效靶點(diǎn)。對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞后，miR-21是否及如何維持高水平表達(dá)，Sun等[10]對(duì)大鼠腎成纖維細(xì)胞進(jìn)行了miR-21功能喪失/獲得實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21可逆轉(zhuǎn)TGF-β介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡蛋白4(PDCD4)下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-21促進(jìn)PDCD4降解；PDCD4通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化阻止活化蛋白1(AP-1)依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄，使成纖維細(xì)胞標(biāo)志物纖連蛋白(FN)和平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)miR-21維持高表達(dá)，形成miR-21/PDCD4/AP-1反饋調(diào)節(jié)；反饋環(huán)中產(chǎn)生的miR-21可以直接降解PTEN，將這種自我促進(jìn)的反饋環(huán)與纖維化機(jī)制聯(lián)系起來(lái)，提示miR-21在腎纖維化持續(xù)惡化中的作用。然而，有學(xué)者認(rèn)為miR-21在特殊情況下具有腎臟保護(hù)作用，整合在腎小管上皮細(xì)胞的miR-21可以直接靶向下游PDCD4/核因子-κB(NF-κB)和PTEN/Akt信號(hào)途徑，發(fā)揮抗炎癥和抗凋亡作用，減輕敗血癥引起的腎損傷[11]。

以上研究說(shuō)明，miR-21具有雙重作用：一方面，通過(guò)TGF-β/BMP7-miR-21-PTEN、miR-21/PDCD4/AP-1等多途徑放大損傷反應(yīng)并促進(jìn)腎臟纖維化；另一方面，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)使腎臟維持正常機(jī)能。miR-21在DKD中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

2 miR-214

大多數(shù)情況下，miR-214被認(rèn)為是骨代謝疾病的關(guān)鍵調(diào)控因子[12]。一項(xiàng)關(guān)于DKD中相關(guān)miRNA的生物信息學(xué)分析顯示，與正常對(duì)照組比較，DKD患者體內(nèi)的miR-214-3p表達(dá)水平明顯增高[13]。

2014年，Denby等[14]實(shí)施單側(cè)輸尿管阻塞實(shí)驗(yàn)(UUO)阻斷TGF-β/Smad信號(hào)通路，小鼠體內(nèi)miR-214水平未受影響；miR-214抑制劑無(wú)法抑制Smad2/3的磷酸化，但能改善UUO引起的腎纖維化。以上結(jié)果表明miR-214的促纖維化作用獨(dú)立于TGF-β/Smad信號(hào)通路。隨后，Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-214可靶向下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中PTEN表達(dá)，提示miR-214可能通過(guò)激活PTEN/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)EndMT。另外，miR-214還參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖或凋亡。研究表明，miR-214可靶向下調(diào)環(huán)氧化酶(COX-2)抑制前列腺素E2的表達(dá)，減弱硫酸吲哚酚引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[16]。在DKD腎纖維化進(jìn)程中，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT的同時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞也會(huì)受病理刺激發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。本研究團(tuán)隊(duì)曾證實(shí)，由成纖維生長(zhǎng)因子受體缺陷介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞EndMT可誘導(dǎo)相鄰腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[17]。因此，如何阻止腎臟發(fā)生EMT也是眾多研究者們關(guān)注的難題。Bera等[18]在糖尿病小鼠的腎皮質(zhì)及高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-214表達(dá)增加，用PTEN的3′-UTR構(gòu)建報(bào)告基因進(jìn)行突變研究，確定PTEN為miR-214的直接靶標(biāo)；抑制miR-214的表達(dá)可恢復(fù)SM22、α2SMA和Ⅳ型膠原纖維的表達(dá)，恢復(fù)PTEN水平，改善DKD引起的腎小球肥大。

盡管未得到完全證實(shí)，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示DKD中上調(diào)的miR-214可能通過(guò)靶向調(diào)控PTEN信號(hào)通路促進(jìn)腎臟EndMT纖維化，同時(shí)miR-214可調(diào)控COX-2介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激失活，失活帶來(lái)的細(xì)胞功能紊亂也會(huì)引起EndMT的發(fā)生，為miR-214的促纖維化作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

3 miR-125b

miR-125b在心肌纖維化中研究較為廣泛。研究表明，心肌發(fā)生纖維化時(shí)，EndMT轉(zhuǎn)化而來(lái)的成纖維細(xì)胞的miR-125b表達(dá)水平是心臟內(nèi)皮細(xì)胞的4倍；miR-125b靶向結(jié)合抗纖維化基因p53的3′-UTR，促進(jìn)心臟EndMT和成纖維細(xì)胞增殖活化[19]。Silambarasan等[20]利用高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與細(xì)胞凋亡模擬糖尿病條件下的血管損傷，進(jìn)行miRNA差異性分析，結(jié)果顯示miR-125b-1-3p隨葡萄糖濃度增加而上調(diào)。

Muramatsu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b在低氧或VEGF刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯升高；miR-125b直接與內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-Cadherin mRNA的3′-UTR結(jié)合抑制其翻譯，影響血管形成。這一結(jié)果提示在低氧和細(xì)胞因子刺激下，miR-125b可能存在促纖維化作用。長(zhǎng)期的高糖環(huán)境會(huì)使內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)受損，炎癥因子高水平表達(dá)。Zhong等[22]在高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行miRNA差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的miR-125b與TNF-α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)的3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)；TNFAIP3通過(guò)拮抗激活復(fù)合物成分中的K63連接泛素化抑制NF-κB信號(hào)，表明miR-125b通過(guò)對(duì)NF-κB抑制劑TNFAIP3的沉默作用，可間接增加NF-κB表達(dá)，促進(jìn)由后者介導(dǎo)的EndMT進(jìn)程。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞miR-125b水平與葡萄糖含量成正比，miR-125b一方面直接抑制VE-Cadherin的表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞黏附作用被破壞，血管無(wú)法維持其通透性；另一方面，miR-125b通過(guò)抑制NF-κB、阻遏蛋白活性，間接增強(qiáng)相關(guān)信號(hào)通路，細(xì)胞更容易發(fā)生纖維化。

4 miR-217

miR-217位于人類(lèi)基因組2號(hào)染色體，通過(guò)不同機(jī)制參與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和耐藥[23]。Shao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，糖尿病患者血清中miR-217表達(dá)明顯升高，且miR-217水平與糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數(shù)、尿蛋白/肌酐比值、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，與抗衰老因子沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-217反映糖尿病患者血糖和抗胰島素水平的同時(shí)，可能通過(guò)參與炎癥、氧化應(yīng)激、纖維化和血管生成，影響DKD的發(fā)生發(fā)展。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Sirt1是miR-217的靶基因，miR-217可通過(guò)Sirt1基因3′-UTR中的結(jié)合位點(diǎn)抑制Sirt1表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞功能退化和提前衰老，最終導(dǎo)致血管生成受損[25]。研究證實(shí)，Sirt1可通過(guò)抑制Smad3的乙酰化水平，參與TGF-β/Smad介導(dǎo)的腎纖維化過(guò)程[26]。以上結(jié)果提示，miR-217/Sirt1/TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)EndMT有正向調(diào)控作用。與此同時(shí)，很多研究表明，miR-217在其他腎臟來(lái)源細(xì)胞中也表現(xiàn)出促纖維化作用。Shao等[27]發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，miR-217在腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)水平升高，同時(shí)伴隨Sirt1表達(dá)下調(diào)和HIF-1α及其下游纖維化因子的生成，從而促進(jìn)DKD的炎癥和纖維化。足細(xì)胞的損傷在DKD中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-217可恢復(fù)腫瘤壞死因子超家族成員11誘導(dǎo)的腎足細(xì)胞凋亡，緩解DKD[28]。但也有學(xué)者在其他纖維化細(xì)胞模型中得出不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。如Gao等[29]的報(bào)告顯示，在TGF-β誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的模型中，miR-217表達(dá)下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-217可抑制TGF-β刺激的細(xì)胞增殖、遷移和ECM沉積；結(jié)合生物信息學(xué)分析、熒光素酶活性檢測(cè)和RNA蛋白檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)了纖維化轉(zhuǎn)錄抑制因子E盒結(jié)合鋅指蛋白1的3′-UTR是miR-217的潛在靶標(biāo)。

以上研究表明，盡管miR-217在不同腎臟細(xì)胞中可能呈現(xiàn)差異性表達(dá)，但與高血糖及DKD密切相關(guān)，并且可能參與調(diào)控DKD狀態(tài)下的EndMT，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

5 miR-155

miR-155高表達(dá)可導(dǎo)致多種惡性腫瘤治療耐藥及不良預(yù)后[30]。Beltrami等[31]發(fā)現(xiàn)，與沒(méi)有DKD表現(xiàn)的糖尿病對(duì)照組比較，DKD患者尿液樣本中miR-155明顯升高，miR-155診斷DKD具有較高的特異性及敏感性。

現(xiàn)已證實(shí)，腎纖維化調(diào)節(jié)因子c-ski可與Smad蛋白的Mad同源域2結(jié)合，阻止Smad被激活，減弱TGF-β/Smad信號(hào)活性。Wang等[32]發(fā)現(xiàn)，miR-155可直接靶向c-ski的3′-UTR，抑制c-ski表達(dá)；抑制miR-155可恢復(fù)TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞EndMT。另外，Chen等[33]研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞中Akt1的3′-UTR與miR-155-5p之間存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-155-5p參與PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控。含Src同源性2域的肌醇5-磷酸酶1(SHIP-1)可將PIP3去磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸，有效終止PI3K途徑的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Tang等[34]發(fā)現(xiàn)，SHIP-1是miR-155的作用靶點(diǎn)，miR-155下調(diào)SHIP-1表達(dá)，參與博來(lái)霉素治療產(chǎn)生的EndMT，涉及到的機(jī)制包括PI3K/Akt、JAK/STAT3和Smad/STAT等信號(hào)通路。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，miR-155與DKD存在密切關(guān)聯(lián)，可作為DKD診斷及病情監(jiān)測(cè)的有效指標(biāo)。miR-155從多途徑參與EndMT進(jìn)程，包括抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，調(diào)控TGF-β/Smad和PI3K/Akt等典型EndMT激活通路等。同時(shí)，miR-155也是常見(jiàn)的致癌性miRNA，若代謝調(diào)節(jié)出現(xiàn)紊亂，會(huì)增加多種疾病的發(fā)病率。

6 miR-433

miR-433在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移發(fā)揮抑癌作用[35]。miR-433還可以靶向COX-2保護(hù)胰島β細(xì)胞免受高糖刺激引起的細(xì)胞損傷[36]。然而，在DKD腎纖維化過(guò)程中，miR-433卻表現(xiàn)為負(fù)面作用。Zhu等[37]在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DKD大鼠腎組織中觀察到miR-433表達(dá)上調(diào)。

有研究表明，miR-433通過(guò)對(duì)抑制抗酶抑制因子1(Azin1)活性的抑制形成正反饋回路，放大TGF-β/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)驅(qū)動(dòng)的腎纖維化[38]。γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶(GCL)是催化抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)合成的關(guān)鍵酶，當(dāng)GSH穩(wěn)態(tài)改變時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞受到活性氧(ROS)的刺激，發(fā)生功能障礙和EndMT。有學(xué)者利用生物信息學(xué)分析確定miR-433為靶向GCLc和GCLm基因3′-UTR的候選miRNA，在內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)miR-433表達(dá)觀察到GCL、GSH表達(dá)下降，細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，提示miR-433特異性參與GCL的激活影響GSH合成，拮抗miR-433可抑制GCL活性，緩解TGF-β依賴(lài)的腎纖維化[39]。

以上研究表明，miR-433在促進(jìn)DKD腎纖維化的同時(shí)，對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激也有一定刺激作用，細(xì)胞內(nèi)ROS大量積累直接影響線粒體供能，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞失活。

7 miR-342

miR-342是一種與肥胖相關(guān)的miRNA，其過(guò)表達(dá)會(huì)引起代謝紊亂。Wang等[40]發(fā)現(xiàn)DKD患者體內(nèi)miR-342特異性表達(dá)上調(diào)。有學(xué)者用TGF-β誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞EndMT，發(fā)現(xiàn)miR-342-5p的表達(dá)水平明顯升高。內(nèi)皮糖蛋白(ENG)作為T(mén)GF-β信號(hào)通路的共受體，可以激活Smad1/5磷酸化，抑制Smad2/3活化，ENG基因的3′-UTR為miR-342的直接靶標(biāo)；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，miR-342-5p抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF受體(VEGFR)活性，減弱VEGF誘導(dǎo)的Akt磷酸化[41]。這提示miR-342-5p可通過(guò)抑制VEGFR和ENG參與TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，增加EndMT發(fā)生的可能。

8 miR-199a

miR-199a存在兩種形式，分別為miR-199a-3p和miR-199a-5p，這兩種miRNA分別調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的活性，參與相應(yīng)的生理病理過(guò)程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，miR-199a在糖尿病患者血漿中表達(dá)明顯升高[42]。微囊蛋白1(CAV1)作為一種膜內(nèi)蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)c-Jun N端激酶途徑抑制TGF-β誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞ECM，發(fā)揮抗增殖、抗纖維化作用。有實(shí)驗(yàn)人員利用輻射誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，發(fā)現(xiàn)纖維化因子Snail被激活。而miR-199a-5p作為Snail的下游介質(zhì)，可直接靶向成纖維細(xì)胞中CAV1基因的3′-UTR，參與纖維化過(guò)程[44,45]。與其他miRNA不同，miR-199a抑制內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時(shí)具備的CAV1，一方面影響內(nèi)皮細(xì)胞膜過(guò)濾作用，促進(jìn)DKD蛋白尿；另一方面影響成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腎纖維化。

綜上所述，在DKD中表達(dá)上調(diào)的miRNA，在DKD腎纖維化病程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，其可能依賴(lài)于經(jīng)典的TGF-β信號(hào)通路或其他非典型信號(hào)通路調(diào)控EndMT的發(fā)生發(fā)展。DKD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床治療效果不理想，miRNA檢測(cè)有助于反映疾病的嚴(yán)重程度，而且，基于miRNA的靶向治療可以提供新的治療策略，脂質(zhì)體或納米顆粒等新的載體可以有效控制劑量及不良反應(yīng)，有效延緩腎纖維化進(jìn)程。盡管EndMT的具體機(jī)制有待闡明，miRNA在DKD靶向治療中的應(yīng)用也面臨著巨大挑戰(zhàn)，但隨著大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床樣本分析的出現(xiàn)，我們將進(jìn)一步了解miRNA與EndMT、腎纖維化之間的聯(lián)系，為腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后評(píng)估提供更多的證據(jù)支撐。