精漿外泌體在精子成熟過程中的調節機制研究進展

杜冠潮，王福，張繼偉，張修舉，高慶和，郭俊，趙豐，郭軍

中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091

中國10%～15%育齡夫婦面臨不孕不育的困擾，其中男性因素占不孕不育原因的40%～50%，精子活力減弱、密度降低等精子質量下降是引起男性不育癥的主要原因之一[1]。尋找有效的藥物載體和治療靶點，對于因精子質量異常而導致的男性不育癥十分重要。外泌體作為一種體液中普遍存在的膜性囊泡，是新發現的細胞間信號傳遞方式，其通過與靶細胞融合或傳遞其內載物，參與細胞間通信、免疫應答、腫瘤發展和轉移等生理和病理過程，是治療疾病的理想載體[2]。精漿外泌體(SE)是來源于男性生殖道內附睪、前列腺以及其他附屬性腺的胞外囊泡，大量存在于精漿中。SE通過向精子傳遞影響精子成熟有關的蛋白質、RNA、脂質、離子等調節男性生殖功能，其攜帶的功能物質能夠影響精子的形態、結構和功能，在精子成熟中發揮了媒介作用[3-4]。現就SE在精子成熟過程中的調節機制綜述如下。

1 SE通過增強精子活力調節精子成熟

SE攜帶的物質通過影響精子鞭毛運動、離子濃度、多元醇代謝途徑及調節細胞信號通路等途徑參與精子活力獲得以影響精子成熟。

附睪小體是由附睪產生的SE，小體內的巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)轉運至精子后，結合于外致密纖維，作用于精子鞭毛上游離的巰基基團，防止二硫鍵的提前形成，消除結合于精子鞭毛上的Zn2+，從而改變精子活力。EICKHOFF等[5]將來自附睪頭部和尾部的精子用不同濃度的重組MIF孵育，發現附睪頭部精子的鋅含量顯著降低50%。同時，培養液中Zn2+的濃度明顯增加，而且精子鞭毛上的游離巰基顯著增多。此外，附睪小體內的miR-888通過調節SPAG6和SPAG1基因來維持精子鞭毛的蠕動和成熟的精子結構[6-7]。

Ca2+在前列腺、附睪的濃度較高，精子活力易受到內外Ca2+的影響，而較高的胞外Ca2+為胞內鈣提供了源泉。BURDEN等[8]報道前列腺小體上的膜聯蛋白能夠調控Ca2+通道，增加精子內Ca2+水平。精子Ca2+通道的激活依賴于與前列腺小體的融合，前列腺小體攜帶的CD38和蘭尼堿受體(RyR)轉移至精子內，刺激產生環腺苷酸二磷酸(cADPR)，控制精子細胞內Ca2+的進出，從而影響精子活力。質膜鈣離子ATP酶4是一種Ca2+外排泵，能夠調節能影響Ca2+信號通路的激活，并保持精子內Ca2+的穩態[9]。前列腺小體中還含有Mg2+和Zn2+等二價陽離子，對于精子質量的調節發揮重要作用，但具體機制仍有待深入研究[10]。

SE內的醛糖還原酶(AR)、山梨醇脫氫酶(SODH)通過調節多元醇代謝途徑參與了精子活力獲得，作用機制先是AR利用電子供體NADPH增加葡萄糖向山梨糖醇的轉變，然后再由SODH經NAD+作為電子受體把山梨糖醇氧化成果糖，通過調控精子能量的來源，從而改變精子的活力[11-12]。

蛋白質組學研究表明外泌體含有參與細胞信號通路的蛋白質，如Wnt家族。GROSS等[13]發現，外泌體表面攜帶Wnt蛋白，誘導靶細胞中的Wnt信號活性，進而發揮生物學功能。CHENG等[14]認為，Wnt信號在精子成熟中發揮了作用，而Wnt信號是由SE轉運到精子，進而調控Wnt/GSK3信號通路，改善精子活力[15]。文獻[16]報道，附睪小體中含有miR-182、miR-24及miR-15b等。研究發現，miR-182和miR-24可靶向調節糖原合成酶激酶3(GSK3)基因表達，而GSK3參與精子細胞中的Toll樣受體信號通路、Wnt信號通路以及環磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)介導的蛋白質磷酸化通路等多條通路的激酶，GSK3磷酸化可影響精子的運動能力[17-18]。

此外王瑞等[19]發現，前列腺小體能夠提高弱精子癥患者精子活力，對正常人群精子活力影響不明顯，具體作用機制尚需進一步研究。卞玉瑩等[20]采用實時熒光定量PCR技術檢測SEmiR-202-5p，發現男性不育癥患者與正常生育健康男性存在明顯差異，且與精子活力密切相關，可能參與了精子成熟的過程。

2 SE通過提高精子抗氧化能力調節精子成熟

活性氧(ROS)是氧的代謝產物，過高濃度的ROS可以誘導細胞的脂類、蛋白和DNA氧化，從而引起一系列的病理變化。精子細胞膜含有多種不飽和脂肪酸，對ROS導致的氧化損傷極敏感。在精子成熟過程中，大部分的細胞質成分會被丟棄，因此精子的抗氧化能力較弱。ROS的氧化損傷導致精子質量下降，影響男性生育力[21]。

附睪提供了大量的酶和非酶抗氧化分子，其功能是保護精子細胞免受氧化損傷。CHABORY等[22]發現，附睪小體內谷胱甘肽過氧化物酶5(GPX5)在精子的抗氧化損傷過程中起關鍵作用，是有效的抗氧化劑清除劑，可保護精子抵抗氧化損傷，從而保證其完整性。通過對Gpx5-/-雄性小鼠和WT雄性小鼠精子的流式細胞術分析發現，Gpx5缺失的小鼠附睪尾的精子DNA緊密度明顯降低，且存在DNA氧化攻擊。對小鼠附睪中表達的酶促清除劑的實時PCR分析表明，Gpx5缺失雄性小鼠的附睪尾上皮組織具有抗氧化反應，以應對過量的ROS。

附睪小體富含附睪精子結合蛋白1(ELSPBP1)，對死亡精子有較高的親和力。SULLIVAN[23]發現，可能在Zn2+存在的條件下，附睪精子結合蛋白1/膽綠素還原酶A(ELSPBP1/BLVRA)的復合物與死亡的精子結合，防止死亡精子產生的ROS對精子的損傷，保護精子抵抗氧化應激。BLVRA利用NADPH作為質子供體降低膽紅素中的膽綠素，后者利用ROS再生膽綠素，這個酶循環實際上是一個ROS清除過程。SAEZ等[24]報道，前列腺小體具有抗氧化特性，通過與產生ROS的多形核嗜中性粒細胞(PMN)相互作用，減少ROS的產生，保護精子，提高精子存活率。

3 SE通過穩定精子膜結構調節精子成熟

精子膜是一種細胞外結構，作為一種生理屏障，維持精子的結構。SE中的蛋白質和脂質有助于維持精子正常活動所需要的膜完整性，并直接反映精子損傷的程度。在精子成熟過程中，精子膜完整性也與精子活力和存活高度相關。

SE與精子的融合有穩固精子細胞膜的作用，主要通過影響精子膜上的脂質來實現。前列腺小體攜帶有大量的膽固醇，且其內膽固醇與磷脂的比值遠遠高于精子細胞膜，而膽固醇可以降低細胞膜的流動性。CARLINI等[25]發現，在pH5.0的弱酸性環境下，前列腺小體與精子融合后，精子依賴這一現象轉移脂質和蛋白質，使精子膜上膽固醇、鞘磷脂等脂質增加，從而改變精子膜的性質。這使得精子膜流動性降低，有利于受精信號的接收。

DU等[26]在實驗中將不同濃度的外泌體加入到精子樣品中，培育2 d，發現添加外泌體精子質膜完整性明顯高于其他樣品；培養10 d，發現添加4倍、16倍濃度外泌體的精子仍保持了60%以上質膜完整。研究證實，SE能夠維持精子膜完整性，提高總抗氧化能力(T-AOC)活性，降低丙二醛(MDA)含量，增加精子活力，延長有效存活時間。

4 SE通過調控精子受精能力調節精子成熟

SE攜帶的部分蛋白質還參與了精子受精能力的獲得。在基因組所有6種透明質酸酶中，精子黏附分子1(SPAM1)是惟一有功能的透明質酸酶。研究[27]表明，SPAM1這種多功能糖基磷脂酰肌醇(GPI)連接蛋白在受精過程中可以被GPI錨定在附睪小體上，在精子穿越卵丘和透明帶的過程中發揮作用。

GIBBS等[28]發現，在精子獲能后，附睪小體攜帶膠質瘤相關蛋白質1(GLIPR1L1)定位在精子頭部的前部區域，同時透明帶結合實驗表，GLIPR1L1在精子與卵母細胞周圍的透明帶結合中起作用。研究數據表明，GLIPR1L1與CAP超家族的其他成員和其他一些蛋白質一起參與了精子與卵母細胞復合體的結合。

前列腺小體主要功能是在射精后與精子相互作用并保護精子，使其保持充分的受精能力，為與卵母細胞相遇做好準備。PONS-REJRAJI等[29]發現，前列腺小體影響精子獲能信號通路，可刺激獲能早期活動，尤其是P110和P80 P-Tyr，顯著減弱了IBMX對P110酪氨酸磷酸化的影響。前列腺小體對與獲能相關的pHi增加沒有影響。當前列腺小體和IBMX同時出現時，[cAMP]i濃度進一步升高。

綜上所述，SE通過增強精子活力、提高精子抗氧化能力、穩定精子膜結構、調控精子受精能力等多種機制參與了精子成熟過程。SE攜帶的大量蛋白、RNA、脂質等功能物質能夠與精子相互作用，這些物質可能成為治療靶點和分子診斷標記，相信通過努力研究，SE的成分和功能將會得到更多的發掘，為男性生殖系統疾病的診療開啟新途徑。