PD-1/PD-L1信號通路在慢性乙型肝炎患者免疫調節中作用的研究進展

劉嬌，戢敏，陳星，喻雪琴，陳芳，趙川

1遂寧市中心醫院，四川遂寧629000；2川北醫學院附屬醫院

乙型肝炎病毒(HBV)是一種嚴重威脅人類健康的病原體。據報道，全球每年約有65萬人死于HBV相關性肝衰竭、肝硬化及肝癌[1]。乙型肝炎發病機制十分復雜且尚未形成共識。HBV感染后的病程及轉歸與病毒、宿主間的免疫應答關系密切，特別是T淋巴細胞介導下的細胞免疫。T淋巴細胞數量減少及功能衰竭是導致病毒不能被有效清除而誘發HBV感染后慢性化的主要原因之一。程序性死亡分子1(PD-1)及其配體(PD-L)是新發現的B7/CD28家族成員之一，是具有負性協同共刺激信號的調節分子。PD-1在慢性感染性及自身免疫性疾病的發生發展及轉歸中起重要的調控作用。這些疾病發生的病原體或誘導疾病發生的影響分子與PD-L結合形成信號通路后，誘導其向T淋巴細胞傳遞負性刺激信號，導致T淋巴細胞數量減少，生物學功能衰減，T淋巴細胞介導下的免疫應答減弱。本文就PD-1/PD-L1信號通路對慢性乙型肝炎(CHB)患者免疫調節的影響作一綜述。

1 PD-1/PD-L1信號通路概述

1.1 PD-1、PD-L1的結構及表達 CD279是Ishida等[2]于1992年從凋亡的T淋巴細胞膜上分離出的單體型Ⅰ型跨膜糖蛋白，稱為PD-1。PD-1由288個氨基酸殘基組成，相對分子質量為55 kD。PD-1由胞外的N端域、跨(穿)膜結構域及胞內結構域三部分組成，與CD28、CTLA-4分別有28%、23%的氨基酸同源性[3]。其胞外區由含有4個N端連接的糖基化位點構成的IgV樣結構域，PD-1/PD-L1信號通路主要通過4個N端連接的糖基化位點發生去磷酸化；胞內結構域的N端酪氨酸殘基通過免疫受體酪氨酸轉換基序(ITSM)來發揮調控作用。當PD-1、PD-L1結合時，ITSM可募集磷酸酶(SHP-1、SHP-2)誘導B淋巴細胞受體或T細胞受體傳遞的效應信號發生去磷酸化，從而發揮負性調節抗原信號的作用[4]。PD-1廣泛表達于CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B細胞、自然殺傷(NK)細胞、樹突狀細胞(DC)及單核細胞等膜表面，而靜息狀態下的T淋巴細胞表面不表達PD-1[5，6]。

PD-1有PD-L1、PD-L2兩個配體。PD-L1與PD-L2有70%的氨基酸同源性，其中有40%氨基酸為一致性。PD-L1由290個氨基酸組成，胞外區由IgV和IgC樣兩個結構域。PD-1與PD-L1間的融合主要發生在IgV樣結構域。PD-L1分布較PD-1更為廣泛，其除在PD-1表達的細胞表面外還可在正常器官如胎盤、心臟、肝、肺等多種組織細胞表面被誘導表達[7]。PD-L2的表達則較PD-1、PD-L1局限，主要在T淋巴細胞、樹突狀細胞、血管內皮細胞、星狀細胞以及肝竇內皮細胞等細胞膜表面表達[8]。

1.2 PD-1/PD-L1信號通路的生物學功能 PD-L1對外周組織有保護作用，保護外周組織不因自身免疫紊亂而受到攻擊。實質細胞通過PD-1/PD-L1信號通路維持機體的免疫耐受狀態；PD-1/PD-L1信號通路被阻斷或破壞時，可誘發或加重慢性感染，促進自身免疫性疾病發生發展及腫瘤的發生[9]。實驗研究結果顯示，PD-1/PD-L1信號通路具有傳遞負性調節信號的功能，可抑制T淋巴細胞活化、增殖及分化，減少γ-干擾素因子(IFN-γ)、白細胞介素10(IL-10)、白細胞介素2(IL-2)等細胞因子分泌，導致T淋巴細胞生物學功能減弱，減低機體對病毒的免疫應答，從而導致病毒持續復制，疾病慢性化。Barber等[8]研究發現，在淋巴脈絡叢腦膜病毒感染的小鼠體內細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表面PD-1表達上調，外周血T淋巴細胞表面水平及其分泌的細胞因子水平降低。研究發現，在乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒、人類免疫獲得性病毒及人類T淋巴細胞病毒等感染中，PD-1在特異性CD8+T和CD4+T細胞膜上表達水平與病毒載量呈正相關[10]。動物實驗研究發現，在阻斷PD-1/PD-L1信號通路后，PD-1、PD-L1表達下降，T淋巴細胞載量及功能、細胞因子分泌功能有所恢復，活躍的病毒復制狀態得到控制[11]。這表明阻斷PD-1/PD-L1信號通路可作為治療慢性病毒感染的新方向。

2 PD-1/PD-L1信號通路對CHB患者免疫的調節作用

2.1 PD-1/PD-L1信號通路與CHB的關系 乙型肝炎的發病機制十分復雜，大部分學者認為宿主免疫功能失衡是其病理性損傷及感染慢性化的主要原因之一；同時指出CHB是免疫介導的疾病，其發生發展與機體免疫活化、肝細胞損傷有關，最終疾病的控制需依賴于機體的免疫狀態。因此免疫調節是CHB治療的一個非常重要的環節。T淋巴細胞作為細胞免疫的主要效應細胞，其數量、功能、亞群比例及細胞因子分泌等與HBV持續感染或感染后的慢性化密切相關。T淋巴細胞在雙信號的誘導下激活，一是T細胞受體專性識別抗原呈遞細胞表面的肽復合物信號刺激；二是T細胞表面的膜蛋白分子及其配體介導的共刺激信號作用。其中CD28/B7、ICOS/B7-H2等正性共刺激分子途徑傳遞活化信號，刺激T細胞增殖和分化；而PD-1/PD-L1作為負性共刺激信號途徑傳遞抑制信號，導致T淋巴細胞凋亡，功能減弱，CHB患者形成免疫耐受狀態。PD-1、PD-L1作為負性共刺激分子傳遞活化信號在CHB免疫調節、疾病的發生與轉歸中發揮著非常重要的調控作用。Liu等[12]阻斷HBV感染土撥鼠PD-1/PD-L1信號通路，小鼠外周血特異性T淋巴細胞功能得以恢復，并認為PD-1/PD-L1信號通路在HBV感染中具有負性調控作用。孫立華等[13]研究結果顯示，CHB患者外周血CTL表面PD-1、PD-L1的表達高于健康體檢組，且PD-1、PD-L1表達水平與HBV-DNA載量呈正相關系。Liang等[14]研究發現，CHB免疫清除階段PD-1表達水平高于免疫耐受階段、靜止期病毒攜帶階段。可見，PD-1、PD-L1表達在一定程度上反映了CHB患者的免疫功能及病情嚴重程度。

CD4+T細胞為T淋巴細胞中的一種輔助性T淋巴細胞，主要通過分泌IFN-γ、IL-17、IL-10及IL-2等細胞因子來誘導和促進B細胞、CTL及其他免疫細胞的活化、增殖與分化，從而介導機體免疫應答。CD8+T細胞具有殺傷效應細胞和調節細胞免疫的作用，是清除病毒的關鍵細胞亞群，若應答失敗會導致病毒處于高水平狀態且不能被清除。在CHB患者中，CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達增加，PD-1/PD-L1信號通路傳遞負性信號因子，導致CD4+、CD8+T淋巴細胞數量減少，功能減退，導致具有抗病毒作用的腫瘤壞死因子α、IFN-γ等細胞因子水平降低。Peng等[15]研究發現，活動期CHB患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達明顯高于急性乙型肝炎恢復期患者。Fan等[16]研究也表明，CHB患者CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達較急性乙型肝炎恢復期患者高，CHB患者外周血CD8+T淋巴細胞功能和數量衰減更為明顯。車財妍等[17]研究發現，CHB患者外周血CD4+T和CD8+T淋巴細胞PD-1的熒光強度明顯高于HBV攜帶者。肝組織內CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達高于外周血[18]。在HBV感染初期，CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達明顯上調，但隨著患者病情狀況的改善和病毒清除，PD-1表達下調，CD8+T淋巴細胞的生物功能和增殖能力復常[15]。PD-1高表達可抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞的增殖與分化，這可能因為機體為控制過強免疫應答而發生的自我調控，防止T淋巴細胞的過度免疫攻擊，避免肝組織損傷，但也成為HBV慢性感染的原因之一。

HBV-DNA是反映病毒復制水平最直接的指標之一。HBV-DNA高載量可誘導PD-1、PD-L1高表達，但同時隨著病毒載量的降低與清除，PD-1、PD-L1的表達也隨之下降。Wang等[19]研究發現，CHB患者高病毒載量組(HBV-DNA>105)外周血T淋巴細胞膜上PD-1表達較低病毒載量組(HBV-DNA<105)增加。葉翩等[20]研究結果顯示，CHB患者CD8+T淋巴細胞表面的PD-1、PD-L1表達高于健康者，并發現CHB患者CD8+T淋巴細胞表面的PD-1/PD-L1表達與HBV-DNA載量呈正相關。但也有部分學者認為，CHB患者外周血PD-1/PD-L1表達水平與HBV DNA載量無相關性，且認為外周血T/B淋巴細胞表面PD-1/PD-L1水平與健康體檢組比較，差異無統計學意義，同時有學者臨床研究認為，CHB患者HBV-DNA陽性組的外周血CD4+T/CD8+T淋巴細胞表面的PD-1/PD-L1表達水平較陰性組比較差異無統計學意義[21]。HBV-DNA載量與PD-1/PD-L1兩者之間相互關系尚未形成共識，有待更進一步地進行大數據、多中心研究來明確。

2.2 PD-1/PD-L1信號通路在HBeAg血清學轉換中的作用 HBeAg是一種可溶性多肽蛋白，多見于血清中HBsAg陽性患者。HBeAg陽性表示患者處于高感染低應答期，HBeAg陰性而抗HBe陽性稱為e抗原血清學轉換，表明CHB患者機體由免疫耐受轉為免疫激活狀態，此時常處于病變活動的激化狀態。相關研究結果顯示，每年發生血清學轉換的CHB患者約占10%。血清學轉換后，多數患者體內病毒復制處于相對靜止狀態，傳染性也相對降低。研究發現，HBeAg可促進PD-1/PD-L1高表達，HBeAg的血清學轉換與CHB患者外周血清中HBV-DNA病毒載量及T淋巴細胞表面PD-1表達密切相關[22]。Tang等[23]研究發現，HBeAg陽性患者CD8+T細胞膜上PD-1表達高于HBeAg陰性患者。柳紅梅等[24]研究發現，HBeAg陽性組外周血CD4+T淋巴細胞表面的PD-1表達上調，并與HBeAg水平呈正相關。PD-1/PD-L1信號通路可能參與并誘導了HBeAg的血清學轉換，這也可能是機體發生免疫耐受的機制之一。

2.3 PD-1/PD-L1與肝組織炎癥程度的相關性 ALT/AST在肝組織發生炎癥時釋放入血，是目前反映肝細胞損傷的最常用指標。在HBV持續性感染時，會導致肝細胞損傷，肝細胞胞漿及線粒體內的多種轉氨酶釋放入血所致。已有研究發現，PD-1/PD-L1表達水平與肝組織炎癥損傷程度密切相關，隨CHB患者的炎癥程度加重其外周血的PD-1/PD-L1表達水平顯著升高。韋麟等[25]研究發現PD-1表達水平與肝組織炎癥活動度呈正相關，在肝組織未出現明顯炎癥時(G0期)，肝組織內PD-1低水平表達。在肝組織炎癥活動度在G1-4期時，PD-1在肝組織內的表達水平高表達，隨肝組織炎癥程度加重，PD-1表達水平顯著升高，G4期的PD-1表達水平較G0～1期顯著升高，二者差異有統計學意義。Germanidis等[26]研究發現PD-1/PD-L1及CD8+T水平與肝組織炎癥程度呈正相關。Feng等[27]研究結果顯示，CHB患者外周血T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1水平與ALT/AST呈正相關系，表PD-1/PD-L1信號通路通過干擾調節T淋巴細胞功能，加速了HBV感染患者病情進展。Xu等[28]通過檢測CHB患者外周血PD-1表達水平與患者ALT、AST水平及病毒載量呈正相關，表明PD-1可作為一個潛在反映肝組織損傷和病毒復制水平的指標之一。但也有部分學者認為PD-1與ALT/AST及TBIL等反映肝組織炎癥活動指標無明顯相關性，僅與T淋巴細胞數量、HBV-DNA載量及HBeAg血清學轉換相關[23]。

2.4 PD-1/PD-L1信號通路在CHB抗病毒治療中的作用

2.4.1 干擾素 干擾素及核苷(酸)類似物(NAs)是目前抗HBV治療的主要藥物。干擾素主要通過介導機體免疫狀態，誘導宿主產生細胞因子及抗病毒蛋白，在多個環節上抑制病毒復制，從而增強機體清除病毒能力。核苷(酸)類似物主要作用于HBV聚合酶，取代病毒復制過程中延長聚合酶鏈所需結構相似的核苷物，從而抑制病毒復制。抗病毒治療可減少CHB患者外周血細胞表面及肝組織中PD-1的表達，抑制病毒特異性T淋巴細胞的負向調控作用，恢復T淋巴細胞清除病毒功能和增殖活性，減輕肝組織炎癥，延緩病情進展。

研究發現，在聚乙二醇α-干擾素抗病毒治療過程中，隨著HBV-DNA載量的下降，CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達下調，CD8+T淋巴細胞功能也隨之恢復，從而加快HBV清除[29]。梁雪松等[30]研究發現，在聚乙二醇α-干擾素抗HBV治療12周時，HBV-DNA載量降低，PD-1陽性的CD8+T細胞比例較基線降低；當治療到12～24周時PD-1陽性CD8+T細胞比例降低，但下降速度減緩，相應病毒載量下降幅度也隨之減弱。提示干擾素可下調CD4+T淋巴細胞的免疫活性，增強CD8+T細胞抗病毒功能，減輕免疫損傷。程健等[31]發現，在抗病毒治療早期，CHB患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞表面的PD-1表達逐漸降低，同時段患者血清中HBV-DNA載量和肝功能損傷指標水平也隨之降低，認為抗病毒治療初期CHB患者外周血T淋巴細胞上PD-1表達變化可作為抗病毒治療效果和疾病預后的預測指標之一。總之，干擾素治療可明確調控CHB患者PD-1、PD-L1表達，促進HBV清除和肝組織炎癥恢復。

2.4.2 NAs NAs能夠快速抑制HBV復制，降低促炎性細胞因子水平，促進肝組織炎癥復常。NAs抗病毒治療過程中，不僅患者體內病毒載量下降，其外周血PD-1、PD-1表達及肝損傷指標(ALT、AST)水平也下降。恩替卡韋(ETV)是目前廣泛應用于臨床抗HBV DNA治療的主要核苷酸類藥物之一，其能有效抑制對拉米夫定耐藥及野生型HBV，具有安全、高效、低耐藥性的特點。張玉喜等[32]研究發現，在ETV抗病毒治療24周，CHB患者外周血單核細胞表面PD-1，PD-L1表達降低，病毒載量顯著減少，肝組織炎癥復常。同時有研究發現，NAs治療24周，CHB患者HBV-DMA載量和肝功能較治療前明顯好轉，外周血CD4+、CD8+T細胞表面PD-1、PD-L1表達較治療前下調[33]。有研究通過對35例血清HBeAg陽性的CHB患者抗病毒治療1年觀察發現，期外周血HBV-DNA、ALT及CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1表達較治療前降低。HBeAg血清學轉換組PD-1表達、病毒載量及ALT水平較未發生HBeAg血清學轉換組下降更顯著[34]。可見，NAs抗病毒治療可下調T細胞表面PD-1、PD-L1表達，促進T淋巴細胞生物學功能恢復，抑制病毒復制，改善病情。阻斷PD-1/PD-L1負性協同信號通路對改善患者免疫功能有一定改善作用。

PD-1/PD-L1信號通路在HBV感染引起的免疫損傷反應中發揮重要的調控作用。該信號通路通過上調T淋巴細胞水平調節機體免疫功能，誘導機體免疫耐受，導致病毒感染持續和疾病慢性化。但隨著PD-1、PD-L1表達升高也可阻斷機體過度的免疫損傷，避免誘發肝衰竭。阻斷PD-1/PD-L1信號通路可使T淋巴細胞數量和功能復常，增強其抗病毒能力，其可能也將成為治療CHB的一個新免疫靶點。PD-1通路抑制劑已在臨床應用于腫瘤及自身免疫性疾病的治療，但尚未用于CHB患者的治療。在CHB的不同免疫階段PD-1、PD-L1表達存在差異，因此阻斷PD-1/PD-L1信號通路的時機尤其重要。這有待進一步研究。