循環(huán)腫瘤DNA檢測在胃癌中的應用進展

席小霞，石定

河南中醫(yī)藥大學，鄭州450000

胃癌是發(fā)病率和病死率極高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤第5位，死亡率居惡性腫瘤第3位[1]。胃癌早期缺乏顯著的臨床特征，大多數(shù)患者確診時已失去最佳治療時機，從而大大降低了5年生存率及生活質量。因此，胃癌的早期診療尤為重要，但臨床腫瘤標記物診斷早期胃癌的靈敏度與特異度不高。液體活檢是一種利用腫瘤患者體液中的循環(huán)生物標志物來提供腫瘤遺傳信息的體外診斷技術，主要用于檢測和分離循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)，作為腫瘤患者基因組和蛋白質組信息的來源。ctDNA檢測即是液體活檢的一種。循環(huán)腫瘤DNA不僅可作為診斷胃癌的生物標志物之一，還可用于胃癌基因突變、擴增、甲基化檢測以及早期診斷、預后等監(jiān)測。本文就ctDNA在胃癌中基因檢測和臨床應用作一綜述。

1 ctDNA的生物學特性

循環(huán)游離DNA(cfDNA)是由正常細胞和循環(huán)腫瘤細胞等凋亡、壞死后釋放到血液中的游離DNA，通常與蛋白質結合形成核小體游離于循環(huán)中，來源于腫瘤的這部分cfDNA，稱為ctDNA。1948年，Mande等[2]首次在人體血液中檢測到cfDNA。然而，對cfDNA的了解僅限于它與自身免疫性疾病及慢性炎癥的關系，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、腎小球腎炎、胰腺炎、炎癥性腸病和肝炎。1977年，Leon等[3]發(fā)現(xiàn)，癌癥患者循環(huán)血漿DNA水平增加。ctDNA是一種以單鏈或雙鏈DNA的形式存在于動物和人類的血液(血漿或血清)、滑膜液或其他體液中的一種游離DNA，其長度小于180 bp，濃度為3.6～5.0 ng/mL[4]。ctDNA產生的機制目前尚未完全清楚，其在腫瘤患者血液中的增加可能是多種方式共同作用的結果[4,5]。

2 胃癌患者ctDNA檢測

ctDNA檢測分為定性和定量檢測。研究表明，ctDNA與腫瘤內部的DNA具有相同的遺傳信息改變如基因突變、腫瘤抑制基因的啟動子的高甲基化、微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性和雜合度的損失[6]。研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA水平與腫瘤大小、TNM分期密切相關，而與患者總體生存率呈負相關[7]。用qPCR檢測術前53例胃癌患者和21例健康對照者的ctDNA水平，結果顯示胃癌患者的ctDNA水平高于健康對照組，胃良性腫瘤患者的ctDNA水平與健康患者的ctDNA水平無明顯差異[8～10]。

2.1 DNA突變檢測 Hamakawa等[10]對含有TP53突變的胃癌患者血漿ctDNA進行大規(guī)模平行深度靶向測序，結果發(fā)現(xiàn)10例TP53突變患者中有3例術前ctDNA中可檢測出TP53突變。Fang等[11]分析了277例原發(fā)性胃癌患者血漿ctDNA中8種基因(ARID1A、TP53、PIK3CA、PTEN、AKT3、BRAF、AKT2、AKT1)的突變譜，發(fā)現(xiàn)ctDNA中TP53、ARID1A、PI3KCA是胃癌患者最常見的突變基因，且ctDNA高水平的患者比ctDNA低水平的患者更易出現(xiàn)血管侵犯，且患者5年生存率低。

2.2 DNA甲基化檢測 研究指出，胃癌患者ctDNA中基因甲基化異常預后較差[12]。Pimson等[13]研究發(fā)現(xiàn)，101例晚期胃癌患者中85%～95%患者血漿ctDNA中存在PCDH10和RASSF1A甲基化。Balgkouranidou等[14]對73例Ⅰ～Ⅲ期可手術胃癌患者血漿ctDNA中的RASSF1A和APC甲基化進行分析，結果發(fā)現(xiàn)ctDNA中RASSF1A啟動子甲基化與臨床預后相關性并不大，但術前ctDNA中APC啟動子甲基化的患者具有較高的病死率。術前ctDNA中SOX17基因甲基化降低了胃癌患者總體生存率[15]。此外，研究發(fā)現(xiàn)術前ctDNA中MINT2啟動子異常甲基化與腹膜播散及腫瘤進展相關；TIMP-3甲基化與患者生存率較差相關[16]。有研究對202例胃癌患者術前不同分期及術后隨訪ctDNA中XAF1的甲基化情況，結果顯示XAF1甲基化術后陰性到陽性的變化與較差的無病生存率相關[17]。綜上所述，ctDNA中甲基化可預測胃癌的預后。

2.3 DNA擴增檢測 表皮生長因子受體2(HER2)是曲妥珠單抗靶向治療晚期胃癌患者的關鍵生物標志物。研究表明,HER2基因擴增或HER2蛋白過表達是導致癌癥進展的原因，大約20%的晚期胃癌患者存在HER2基因擴增或HER2蛋白過表達[12]。Shoda等[18]用數(shù)字液滴PCR(ddPCR)法對胃癌患者ctDNA中HER2表達進行了實時評估，術后隨訪顯示53.84%的患者復發(fā)時血漿ctDNA中HER2表達較高，即使手術時診斷為HER2陰性的患者也是如此。因此，通過ddPCR檢測ctDNA中HER2表達可為胃癌患者預后評估提供新方向。

3 ctDNA在胃癌診療中的應用

3.1 篩查及診斷早期胃癌 目前ctDNA作為篩查手段的最大挑戰(zhàn)可能是靈敏度和特異度不高。而近期的一項Meta分析顯示，ctDNA診斷胃癌的靈敏度為62%、特異度為95%。但Meta分析中ctDNA的檢測方法、基因靶點、患者種族等存在明顯異質性，需進一步研究以闡明ctDNA在胃癌中的診斷價值[19]。目前的證據顯示，ctDNA的靈敏度并不高于傳統(tǒng)的蛋白標志物(癌胚抗原、癌抗原125、癌抗原724等)，ctDNA與傳統(tǒng)蛋白標志物結合診斷的靈敏度為60%～75%[20]。

3.2 預測胃癌預后 Survivin可抑制細胞凋亡。胃癌液體活檢顯示，ctDNA中Survivin的表達可獨立預測患者的生存期，但只有細胞質表達的Survivin對總生存率有顯著影響，而細胞核表達的Survivin對預后無影響[21]。Cao等[22]進一步研究發(fā)現(xiàn)，患者術后血漿ctDNA中Survivin mRNA的表達與腫瘤大小、淋巴結轉移及高分化有關。此外，Rawnaq等[23]對92例胃腸道腫瘤復發(fā)的患者血漿ctDNA進行檢測，結果顯示微衛(wèi)星DNA雜合性丟失與腫瘤復發(fā)存在一定的關聯(lián)，但與總生存期無關。研究指出ctDNA中膜1型基質金屬蛋白酶可作為預測胃癌復發(fā)和遠處轉移的預后指標[24]。晚期胃癌患者血液ctDNA中程序性死亡-配體1(PD-L1)mRNA表達高于早期胃癌患者，且PD-L1表達與腫瘤的浸潤深度、轉移程度及分期有相關性[25]。

3.3 監(jiān)測胃癌的耐藥 ctDNA可實時反映腫瘤組織的當前狀態(tài)，故可定性定量檢測ctDNA表達來分析藥物的療效。克唑替尼可有效治療原癌基因，受體酪氨酸激酶(MET)擴增性胃癌，但部分患者仍產生耐藥。Lennerz等[9]通過新一代測序對Ⅳ期胃癌患者ctDNA中的MET、FGFR2基因進行定期突變分析，結果提示ctDNA中MET的反復擴增和繼發(fā)性突變、FGFR2基因的相對拷貝數(shù)增加及下游相關元件的突變等是胃癌產生耐藥的主要原因。40%～50%的胃癌患者ctDNA中存在HER2和(或)表皮生長因子受體(EGFR)的共擴增，可能驅動產生新的耐藥性[26]。有研究采用靶向捕獲測序分析了39例早期胃癌患者中的173個連續(xù)ctDNA樣品，用來分析曲妥珠單抗耐藥機制，結果發(fā)現(xiàn)早期胃癌患者中的耐藥基因為EGFR和CNV[27]。因此，ctDNA用于胃癌耐藥性的監(jiān)測。

3.4 監(jiān)測胃癌術后復發(fā) ctDNA可作為監(jiān)測殘留腫瘤復發(fā)的生物標志物。Kim等[28]采用全基因組測序對25例術后胃癌患者ctDNA進行個體化腫瘤特異度重排分析，結果顯示19例患者中發(fā)現(xiàn)腫瘤特異度重排；除此之外，胃癌患者術前ctDNA陽性與術后12個月內胃癌復發(fā)顯著相關，提示術后ctDNA監(jiān)測對預測胃癌患者復發(fā)有重要意義。胃癌術后ctDNA持續(xù)高水平預示復發(fā)的可能[29]。但也有研究表明，胃癌復發(fā)患者其術后ctDNA陰性，因此ctDNA并不能作為胃癌復發(fā)的生物標志物[30]。因此，仍需更多的研究進一步證實ctDNA在胃癌術后復發(fā)中的作用。

ctDNA為胃癌的基因檢測、早期診斷、生存預后、耐藥監(jiān)測、術后復發(fā)監(jiān)測等方面開辟了新的視角。但目前國內外研究仍停留在小范圍樣本監(jiān)測上。因此，仍需更多前瞻性、多中心、大樣本的研究驗證ctDNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的應用價值。雖然目前ctDNA在臨床中的應用有限，但具有通用性，其有可能成為腫瘤診斷及預后預測的指標之一。