急性低氧誘導人肝癌細胞差異表達基因的篩選及其功能

路遠，韋花媚，譚川，吳賢建，邵澤生，伍毅，許佐明，李文川，浦澗

1右江民族醫學院附屬醫院·廣西肝膽疾病臨床研究中心,廣西百色533000;2右江民族醫學院

肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的癌癥之一，是癌癥相關死亡的常見原因[1]。大部分HCC患者在就診時已處于晚期[2]。HCC主要與乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染、飲酒或代謝綜合征有關[3]。當機體對氧氣的需求超過其供應時，全身或局部組織中的氧含量降低，稱為低氧。如果機體不能適應低氧環境，會引起一系列病理生理反應。低氧時，組織的代謝、功能、形態結構都會發生變化，過度低氧將導致機體功能出現衰竭，神經系統、循環系統、呼吸系統等均會遭受不同程度的損傷，甚至導致腦、心、肺等重要器官死亡。同時，低氧與腫瘤進展密切相關[4]。腫瘤細胞新陳代謝旺盛，正常的組織供氧能力滿足不了細胞的需求，且腫瘤內部新生血管紊亂，絕大部分實體瘤處于低氧環境[5]。低氧會誘導細胞周期停滯、細胞增殖、抑制凋亡、血管生成進而促進腫瘤細胞侵襲轉移，對治療產生耐受性，進而直接降低治療效果。據報道，腫瘤轉移導致了90%的腫瘤患者死亡[6]。人肝癌細胞株Huh-7、Hep3B對低氧尤為敏感，是研究低氧對腫瘤影響的理想細胞系。2018年4月～2019年4月，本研究建立低氧誘導的Huh-7、Hep3B細胞模型，采用基因芯片技術檢測細胞中差異表達的基因，并分析其功能。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系Huh-7、Hep3B購于中國科學院干細胞庫。DMEM、胎牛血清購于Gibco；青霉素、鏈霉素購于諾維贊公司；TRIzol購于Invitrogen公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇購于國藥集團化學試劑有限公司。Thermo NanoDrop 2000和Agilent 2100 Bioanalyzer購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Gene Chip Clariom S Array芯片購自上海吉凱基因科技有限公司，RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，掃描儀(GeneChip Scanner 3000)購自美國昂飛公司。

1.2 細胞低氧誘導 將Huh-7、Hep3B細胞用DMEM添加10%胎牛血清置于37 ℃培養箱培養。培養至細胞融合度為70%時，隨機取部分細胞置于常氧條件(空氣、5% CO2)下培養，取部分細胞置于低氧條件(1% O2、5% CO2、94% N2)下培養，均培養20 h后收樣。

1.3 差異表達基因篩選 當細胞培養至密度為80%時，使用TRIzol法按照細胞總RNA提取試劑盒操作說明，提取細胞總RNA。用Thermo NanoDrop ND 2000紫外分光光度計檢測A260/A280值分別為2.04、2.01、2.07、1.97；用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA的質量，RNA質量符合芯片質量要求。吸取First-Strand Master Mix 5 μL加入5 μL Total RNA/Poly-A Control Mixture 中，混勻，按照cDNA第一鏈程序孵育第一鏈，以第一鏈為模板進行cDNA第二鏈的合成。將IVT master mix 30 μL加入二鏈合成產物中，混勻，合成標記cRNA。同時完成cRNA生物素標記。再將純化并定量的體外轉錄后的cRNA產物經高溫高鹽處理化成35～200 bp片段。片段化的cDNA通過末端脫氧核苷酸轉移酶使用Affymetrix公司專有的DNA標記試劑共價連接至生物素。將片段化的cDNA與其他對照試劑混合，制備成雜交液，將雜交液注入芯片中，將芯片放入雜交爐，45 ℃ 60 r/s旋轉孵育16 h后取出芯片，加入洗脫液和染色液，在全自動的洗脫染色工作站(Fluidics station 400)中完成洗脫和染色。用掃描儀(GeneChip Scanner 3000)進行芯片掃描，收取基因表達的熒光信號值，用內參基因對獲得的原始信號進行均衡和校正。用Microarray suite software信號處理軟件對掃描的圖像進行數字化處理，計算熒光信號的強度和比值。

1.4 差異表達基因的功能分析 樣品間差異統計使用錯誤發現率(FDR)與log2Fold Change(log2FC)，篩選條件為錯誤發現率(FDR)<0.05且|log2FC|>1。獲得差異表達基因后，分別使用Kolmogorov-Smirnov和KOBAS version 2.0對差異表達基因進行基因本體論(GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析。以Q-value≤0.05為閾值，滿足此條件的功能聚類分享(GO term)和信號通路(Pathway)定義為在差異基因中顯著富集的GO term和Pathway。

2 結果

2.1 差異表達基因的篩選結果 與常氧處理的細胞相比，急性低氧誘導的Huh-7細胞中差異表達≥1.5倍且FDR<0.05的基因共計392個，其中表達上調基因266個，表達下調基因126個；急性低氧誘導的Hep3B細胞中，低氧誘導差異表達≥1.5倍且FDR<0.05的基因共計2 260個，其中表達上調基因847個，表達下調基因1 413個。急性低氧誘導的Huh-7細胞與Hep3B細胞共同的差異表達基因共177個，表達上調的127個，表達下調的50個。

2.2 差異表達基因的GO功能 低氧誘導Huh-7細胞的差異表達基因GO功能分析：在生物學過程(BP)層面上主要介導小分子代謝、生物合成過程、細胞氧化應激過程；在分子功能(MF)層面上主要富集于酶結合、金屬離子結合、激酶結合；在細胞組分層面上主要參與胞外間隙、細胞質膜組成、內質網的調控。低氧誘導Hep3B細胞的差異表達基因GO功能分析：在BP層面上主要介導小分子代謝、含磷復合物代謝、細胞周期過程；在MF層面上主要富集于核糖核酸結合、酶結合、核苷酸結合；在細胞組分層面上主要參與線粒體組分、細胞骨架、微管構成。

2.3 差異表達基因的KEGG功能 低氧誘導的人肝癌Huh-7細胞中共有2 052條差異表達基因比對到31條通路中。選取Q-Value從小到大排序前10的通路，分別為糖酵解途徑、MAPK通路、細胞周期、癌癥、類固醇合成、系統性紅斑狼瘡、戊糖磷酸途徑、過氧化物增殖途徑、Toll樣受體通路。

低氧誘導的人肝癌Hep3B細胞中共有3 070條差異表達基因比對到31條通路中。選取Q-Value從小到大排序前10的通路，分別為細胞周期、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、p53信號通路、氧化磷酸化作用、癌癥、氨基酸降解、MAPK通絡、帕金森病通路。

從Huh-7細胞與Hep3B細胞共同的差異表達基因中選擇表達變化最大的5個基因TXNIP、ATF3、SLC6A8、TIPARP、PFKFB4，進行信息查詢，結果顯示TXNIP、ATF3、PFKFB4均與肝癌發生相關。TCGA數據分析顯示，SLC6A8基因在肝癌組織中表達升高。

3 討論

目前，關于癌癥(肝癌、肺癌、前列腺癌、結直腸癌等)的轉錄組測序及其差異基因表達已有諸多報道[7，8]。通過轉錄組測序篩選出的差異表達基因，可能在癌癥進展過程中發揮關鍵作用，并可作為癌癥潛在的生物標記物和治療靶點。

健康的組織可通過自我穩態調節來實現氧濃度的平衡，使組織內氧濃度維持在2.5%～9%[9]。當組織發生病變或炎癥反應時，由于細菌和病原體代謝增強、血管損壞、炎癥細胞浸潤，大量消耗組織內的氧，使得組織含氧量低于1%，產生了低氧狀態。低氧是重要的腫瘤微環境，惡性腫瘤組織內異常血管生成、血管灌注減少及腫瘤細胞無限制的生長，導致微環境中氧含量降低，這一現象在實體腫瘤中普遍存在。在低氧微環境中腫瘤會發生一系列的生物學變化，引起能量效率與控制細胞增殖的關系失調，從而促進腫瘤的快速生長[10]。而目前關于低氧對癌癥基因表達的影響鮮有報道。為了揭示低氧對癌細胞基因表達的影響，本研究采用對低氧敏感的人肝癌細胞Huh-7、Hep3B探討低氧誘導對癌細胞的影響，獲得了不同數據庫的測序數據，同時篩選相關差異表達基因。本研究中Huh-7、Hep3B細胞經低氧處理后，用基因芯片篩選得到多個差異表達的基因。這些表達差異的基因可能參與了低氧環境下肝癌的發生發展。

研究表明，低氧微環境主要受低氧誘導因子1α(HIF-1α)調控，而HIF-1α在多種癌癥中高表達，參與癌細胞的生長、遷移、血管生成和細胞凋亡。HIF-1α能促進也能抑制細胞增殖[11]，同時有研究發現，低氧抑制成骨細胞增殖的同時也促進其凋亡[12]，而長期低氧則抑制牙周膜細胞增殖[13]。低氧脅迫能改變斑馬魚和鰱魚心臟、肝臟等器官中的周期相關蛋白的表達；差異表達基因主要通過降低細胞周期蛋白D1(CyclinD1)-周期蛋白依賴性激酶復合物將細胞周期阻滯在G1/S和S/G2期[14]。低氧通過上調影響肝癌細胞周期的生長因子如CyclinD1、轉化生長因子、胰島素樣生長因子2的表達，促進肝癌細胞的增殖分化，完成細胞周期進程[15]。本研究發現，KEGG通路富集顯示低氧誘導Huh-7、Hep3B細胞中差異表達基因參與細胞周期的調控，這與以上研究結論一致。

低氧可激活許多復雜的細胞內信號通路。在低氧環境下趨化因子、細胞因子和依附在G蛋白偶聯受體、酪氨酸激酶受體、Toll樣受體(TLR)的生長因子可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、核因子κB、絲裂原活化蛋白激酶信號通路。TLR是固有免疫中關鍵的模式識別受體，不僅介導了免疫系統的激活和細胞凋亡，與腫瘤的生長侵襲也密切相關[16]。腫瘤細胞上的部分TLR可通過炎癥反應依賴或非依賴地促進腫瘤生長，如TLR2和TLR4通過誘導炎癥的發生形成腫瘤炎癥微環境，促進腫瘤的發生。TLR的激動劑已被證實具有強烈的抗腫瘤活性，可以刺激耐藥宿主細胞的免疫系統，進而殺死或損傷腫瘤細胞[17]。MAPK信號通路調節CyclinD1和p27的表達，從而影響細胞周期G1至S期的進程。MAPK信號通路還對許多轉錄因子(CREB、c-Fos、c-Jun、Elk-1)有調控作用，并通過調控下游轉錄因子的磷酸化來發揮功能[1]。本研究發現，低氧誘導Huh-7細胞的差異基因富集在TLR信號通路，表明低氧可能在肝癌細胞中引起炎癥反應。低氧誘導的Huh-7和Hep3B差異表達基因均涉及MAPK通路，這與低氧可引起細胞周期相關基因表達改變的結果相符。

60%的慢性和急性實體腫瘤中存在低氧現象[18]，因此低氧已經成為侵襲性腫瘤的一種病理現象。癌細胞的平均含氧量低于4.4%，在某些聚焦區域可能為0[19]。這主要是由于供需之間的不平衡，腫瘤細胞異常快速增殖需要消耗大量氧氣，超過正常的組織供氧。低氧微環境的形成也可能是由于腫瘤細胞中血管網絡運輸效率低或者血紅蛋白含氧量低造成的。持續的低氧會改變腫瘤的幾何形狀，獲得上皮-間充質轉化的表型，從而增強癌細胞的轉移侵襲能力，助其擴散至身體的其他部位，促進腫瘤的惡性進展。此外，氧氣供應不足會改變癌細胞的新陳代謝，并導致腫瘤的表型多樣性。低氧還可以限制治療藥物灌注，從而導致腫瘤化學、生物、放射和熱治療的耐受性[18]。本研究發現，低氧誘導Huh-7和Hep3B細胞表達變化顯著的基因TXNIP、ATF3、PFKFB4均與肝癌發生相關。證實低氧與癌癥的發展密切相關。

本研究僅選擇兩株肝癌細胞進行低氧誘導，篩選差異表達基因，將來應采用更多的肝癌細胞對該結論進行驗證。另外本研究僅從細胞層面探討低氧對腫瘤發生的作用，研究比較局限，應進一步從動物實驗及臨床進行探討。