不同消毒藥物對斷奶羔羊舍空氣中大腸桿菌的殺菌效果研究

許國洋，付利芝，徐登峰，張素輝

（重慶市畜牧科學院，重慶市獸用生物制品工程技術研究中心，重慶 榮昌 402460）

大量臨床數據表明，大腸桿菌引發的羔羊腹瀉是養羊場的一種常見疾病［1］，本研究圍繞常規消毒藥物對大腸桿菌的消毒效果進行分析，針對性解決斷奶羔羊腹瀉常發的難題，為防控大腸桿菌性羔羊腹瀉提供數據支撐，也為羊舍臨床消毒藥物的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 培養基及消毒藥物 選用麥康凱瓊脂培養基對空氣中的大腸桿菌進行分離培養和計數。選擇的消毒藥物為聚維酮碘、戊二醛、苯扎溴銨。參照許國洋等［2］的方法設計合成細菌通用引物，引物序列信息為F：5′-AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3′，R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 大腸桿菌的分離鑒定 利用麥康凱瓊脂培養基對斷奶羔羊舍內空氣中的大腸桿菌進行分離培養，經革蘭氏染色鏡檢觀察，并通過細菌通用引物F/R 擴增分離菌的16S rRNA 基因序列，PCR 產物送生工生物工程有限公司進行測序分析。

1.3 藥物敏感性分析 將直徑為6 mm的空白圓形濾紙片于121 ℃高壓滅菌15 min，烘干備用。將處理好的空白紙片置于含有消毒藥物的西林瓶中，12 h后取出，37 ℃烘干備用。采用常規紙片瓊脂擴散法（K-B），檢測分離到的大腸桿菌對不同藥物的敏感性。測得的抑菌圈直徑＜10 mm，表示對藥物不敏感，抑菌圈直徑在10～15 mm 表示對藥物中度敏感，抑菌圈直徑＞15 mm 表示對藥物高度敏感。

1.4 羊舍空氣中的細菌檢測 采用自然沉降法檢測消毒前后羊舍空氣中的大腸桿菌數量變化。將各培養基暴露于空氣中5 min，置于37 ℃恒溫培養箱中培養，24 h 后對平板中的微生物進行計數。所有檢測數據均使用SPSS 2.0 統計分析。

舍內空氣中菌落數的計算公式為：細菌數（CFU/m3）＝N×100/A×5/T×1 000/10＝50 000N/AT。式中，A為平板面積（cm2），T為平板暴露時間（min），N為平板平均菌落數（CFU）。

2 結果

2.1 大腸桿菌的分離鑒定 通過對斷奶羔羊舍內空氣中大腸桿菌的分離鑒定，獲得1株革蘭氏陰性短桿菌。利用細菌通用引物，在1 500 bp 位置擴增出單一條帶，測序結果表明其大小為1 468 bp，見圖1。在NCBI 中比對分析，發現其與大腸桿菌（NCBI 登錄號：NR_024570.1）的同源性最高（達99%）。

圖1 16S rDNA PCR擴增產物

2.2 藥敏試驗結果 通過測定大腸桿菌對不同藥物的敏感性，發現其對苯扎溴銨高度敏感，抑菌圈直徑達21 mm，與聚維酮碘和戊二醛差異極顯著（P＜0.01）。詳見表1。

表1 藥敏試驗結果

2.3 消毒前后大腸桿菌總數測定分析 通過對消毒前后舍內空氣中大腸桿菌的統計分析，發現消毒前后各圈舍空氣中的大腸桿菌數均發生變化，結果見表2。

2.4 消毒效果分析 通過對消毒前后各組大腸桿菌數量的變化分析，發現消毒后聚維酮碘組與苯扎溴銨組的大腸桿菌數均減少，戊二醛組和對照組升高。其中，苯扎溴銨組與戊二醛組、對照組差異極顯著（P＜0.01），與聚維酮碘組差異顯著（P＜0.05）；聚維酮碘組與戊二醛組、對照組差異極顯著（P＜0.01），戊二醛組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。詳見圖2。

表2 消毒前后大腸桿菌數統計結果

圖2 消毒前后大腸桿菌數量變化

3 討論

當前，羊群的集中化管理給疫病的傳播創造了良好條件，因此，環境消毒尤為重要［3］。腹瀉是一種胃腸道性疫病，病原菌感染是其主要病因。隨著養羊業的發展，大腸桿菌誘發的羔羊腹瀉問題日益嚴重［4］。大腸桿菌具有多個血清型，存在區域性差異，且易產生耐藥性，因此，開展針對斷奶期羔羊腹瀉的研究十分必要［3］。

沉降法檢測出的環境微生物數量，可以客觀地反應空氣污染的程度和衛生通風情況，是判斷空氣污染的指標之一，也是評判空氣消毒除菌效果的重要指標。本研究發現苯扎溴銨與聚維酮碘的殺菌效果明顯，經其消毒后空氣中大腸桿菌的含量均下降，其中又以苯扎溴銨的消毒效果最好。綜合考慮藥物的消毒效果和舍飼山羊的發病情況，建議對羊場消毒程序作優化改進，推薦使用聚維酮碘和苯扎溴銨輪換對斷奶羔羊舍進行舍內消毒。