水稻成蘗特性及相關氮同化酶活性、基因表達分析

安 琪，季雯珺，何永剛，章志宏

（武漢大學生命科學學院/雜交水稻國家重點實驗室（武漢大學），武漢 430072）

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一，養活了全球一半以上的人口。水稻產量的構成因素包括單位面積有效穗數、每穗穎花數、千粒重和結實率等［1］。而水稻分蘗直接決定有效穗數，并對每穗穎花數、結實率和千粒重有重要影響。

水稻分蘗的形成過程主要包括分蘗芽的形成與分蘗芽的伸長［2-4］。在每個葉位的葉腋里一般都能形成一個腋芽，也叫分蘗芽，分蘗芽能夠進一步伸長生長形成分蘗。影響水稻成芽、成蘗的因素包括環境因素和遺傳因素。環境因素包括光、溫、水、肥等［5，6］。有研究表明，水稻分蘗芽在三幼一基期對環境最為敏感［7］。氮素是植物生長所必需的大量元素之一，也是決定植物生物量和作物產量的主要限制因素［8，9］。在水稻營養生長期，充足的氮素供應可以促進分蘗［10］，氮供應不足會導致有效分蘗數大量減少［11］。遺傳因素包括調控腋芽形成和調節分蘗芽伸長的基因、植物激素、碳/氮同化相關基因等。影響腋生分生組織分化形成腋芽的基因有TE/TAD1、MOC1、MOC3、LAX1 等。 水 稻TILLERS ABSENT1（TAB1）與擬南芥WUSCHEL（WUS）基因同源，參與腋生分生組織的發育起始［12］。MOC1（monoculm1）是第一個被確認為控制水稻分蘗的基因，該基因突變體的葉腋處不能形成分蘗芽，在成熟期只有一個主莖稈［2］。單蘗突變體MOC3（monoculm3），由于一個點突變而導致TAB1 基因的提前終止，從而妨礙了分蘗芽的形成。TE/TAD1 通過調控MOC1 的降解來調控水稻分蘗。TAD1 編碼含有細胞分裂后期促進復合體/細胞周期體（APC/C）和多亞基E3 連接酶的一個共激活蛋白，同APC/C 復合體的亞基CDC27 直接相互作用［13，14］。TE 與MOC1 在葉腋中共表達，真核生物中功能高度保守的E3 泛素連接酶APC/C 與TE 形成復合體APC/CTE，通過26S 蛋白酶體泛素化降解MOC1［13，14］，從而使水稻分生組織特異性基因homeobox1 的表達下調，抑制腋生分生組織的起始與形成［13］。APC/CTE能夠保守性地降解細胞周期中的關鍵調控因子，從而特異性地調控分蘗發生，影響水稻株型和子粒產量［13，15］。

SLs 信號通路在植物分蘗形成中具有重要的調控作用，其中涉及到的基因包括SLs 合成途徑的基因D27、D17、D10 和SL 信號傳導的基因D14、D3、D53。如水稻的D10（DWARF10）與擬南芥的MAX4是直系同源基因，編碼一個類胡蘿卜素裂解雙加氧酶，參與SL/SLs 的生物合成，控制水稻側芽向外生長［16］。 HTD1（HIGH-TILLERING DWARF1）/D17 編碼水稻中類胡蘿卜素裂解雙加氧酶OsCCD7，在類胡蘿卜素衍生物的合成中發揮作用，負調控水稻側芽生長［17］。突變體d27 中生長素的極性運輸能力增強，表現出分蘗增加和株高變矮的表型。D3 通過控制分蘗芽的休眠性從而抑制分蘗芽的活性。d3突變體中有觀察到對于下胚軸的生長缺陷，因此D3可能調控多個發育階段中不同蛋白質的降解過程，也對分蘗階段進行調控［18］。HTD2/D14/D88 編碼一個α/β 折疊水解酶超家族的蛋白，抑制水稻分蘗的發生，負調控水稻分蘗數［19-21］。HTD2 的突變不影響分蘗芽的形成，但對隨后分蘗芽的向外伸長生長有影響，導致分蘗增加、植株矮化的表型［19］。IPA1/OsSPL14 作為SPL 基因家族的一員，起著轉錄因子的作用，在營養生長階段，IPA1 控制水稻分蘗；在生殖生長階段，IPA1 的高表達促進了穗分枝。IPA1 能與一些基因的啟動子直接結合，如直接正向調控水稻株型的重要基因DEP1 以及負向調控水稻分蘗芽生長的關鍵基因OsTB1，進而分別抑制水稻分蘗發生和調節水稻穗長和株高［22］。

調控水稻分蘗的激素包括生長素、細胞分裂素和獨角金內酯等。生長素和獨角金內酯抑制分蘗芽的生長發育［23，24］，而細胞分裂素則促進分蘗芽的生長［25］。解釋植物激素調控分蘗發生的2 個模型［26］，一個是生長素第二信使模型：IAA 通過正調控SL、負調控CK 起作用，而SL 和CK 進一步調控蘗芽伸長的基因從而調控蘗芽生長。另一個是生長素運輸通道模型：IAA 運輸通道被SL 所抑制，SL 會抑制IAA 運輸蛋白PIN，從而抑制IAA 從分蘗芽中輸出，進而抑制腋芽的生長［26］。

水稻育種和生產實踐表明，低節位、早發分蘗在拔節期具有與主莖媲美的生物量，在成熟期穗部性狀上更接近主莖，對植株產量的形成具有更大貢獻。目前專注于水稻低節位、早發分蘗的深入研究很少。本研究在考察水稻品種低節位、早發分蘗遺傳變異的基礎上，較深入地探究了水稻低節位、早發分蘗的分子遺傳基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及種植

選用具有不同分蘗特性的水稻品種天優華占、岳4B、明恢63、揚兩優6 號、Y 兩優800、中嘉早17、黃 華占、HR901、鄂早18、Basmatis、Lemont 和Star Bonnet 為材料，采用水培法培養水稻秧苗，營養液配方為改良后的國際水稻研究所（IRRI）常規營養液配方［27］。水稻種子浸種10 h、瀝水2 h，再用強氯精2 g 對水800 mL，浸種10～12 h，后用清水沖洗多次，于8 月18 日播種于潮濕的蛭石中，室外遮陰待種子發芽。第1 葉展開后，移至自然條件下光照培養，用1/4 營養液澆灌，2 葉開始用1/2 營養液。8月27 日選取2 葉1 心的水稻秧苗移栽到水培泡沫盤中，每穴1 苗，株、行距為6 cm×9 cm，每個品種在2 個水培盆（60 cm×36 cm×12 cm）中種植42 株。移栽后用全營養液培養，每隔2 d 更換一次營養液，每個培養盆用營養液10 L；5～6 葉期，每盆用營養液15 L。每天用HCl 或NaOH 調節營養液的pH 為5.0～5.5，并適當補充揮發掉的水份。各葉齡期間隔取樣，以保證每個水稻品種相對生長環境一致。

1.2 水稻秧苗分蘗特性及相關農藝性狀的觀測

在水稻秧苗培養過程中，每天觀察記錄分蘗發生情況。新的分蘗發生，以該分蘗的第1 片葉伸出著生葉鞘1 cm 為記錄標準。

每個水稻品種3 葉1 心至5 葉1 心時期，每個葉齡取樣5 株，測定各葉齡時期的苗高、根長、各葉片的葉長、葉寬、SPAD 值。隨后，對取樣材料用105 ℃殺青10 h 左右，80 ℃烘干至恒重，測定各器官及全株的干物重。

1.3 水稻秧苗生理生化指標的測定

晴天上午10：00—11：00，每個水培盆隨機取3～4 葉期水稻秧苗5 株，選擇完全展開葉，將葉片放入液氮中保存，用于酶活性檢測；葉鞘置于牛皮紙袋中105 ℃殺青，80 ℃烘干至恒重，用于可溶性糖含量測定。

粗酶液提取及保存參考盧永恩［28］的方法，谷氨酰胺合成酶（GS）活性檢測參考Rhodes 等［29］的方法，NADH-GOGAT（谷氨酸合酶）活性測定參照Leyser［25］的方法進行。NADH-GDH（谷氨酸脫氫酶）活性測定參照Turano 等［30］的方法進行?？扇苄蕴堑臏y定參考張志良等［31］的《植物生理學實驗指導》。

1.4 水稻秧苗基因表達的測定

晴天上午10：00—11：00 取3～4 葉期水稻秧苗，用于銨態氮同化相關酶合成基因、生長素和細胞分裂素合成基因的表達檢測；每個水培池隨機取5株，取分蘗節和芽放入液氮中保存，用于分蘗相關基因的表達檢測。

RNA 提取采用TRIzol（Invitrogen 公司）提取法；DNA 消化用DNaseⅠ購自Thermo 公司；反轉按照THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix QPS-201 說明書操作，試劑購自上海碩盟生物科技有限公司。

1.5 數據處理

利用Excel 軟件記錄整理數據，采用SPSS 20.0軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 水稻秧苗分蘗發生動態

從水稻秧苗在播種后18～34 d 的分蘗發生動態（表1）來看，12 個供試品種的分蘗特性具有較大變異。其中，天優華占、揚兩優6 號、岳4B 和明恢63 4 個品種，在播種后18 d 時單株分蘗數達0.9～1.3個，隨后一直保持較高的單株分蘗數，屬于分蘗早發類型的品種。Y 兩優800、中嘉早17、黃華占和Basmatis 4 個品種，在播種后18 d 時的單株分蘗數為0～0.2 個，但隨后快速增長，單株分蘗數僅次于上述分蘗早發類型的品種，屬于蘗性居中類型的品種。HR901、鄂早18、Lemont 和Star Bonnet 4 個品種在播種后18 d 時均未發生分蘗，播種后22 d 也只有HR901 的單株分蘗數為0.1 個，此后的分蘗增長一直較慢，這幾個品種屬于分蘗遲發類型的品種。從表1 顯著性分析也可以看出，播種后18～26 d，分蘗早發類型的4 個水稻品種分蘗數與其余8 個水稻品種一直都有顯著性差異。播種后22～30 d，分蘗早發類型、蘗性居中類型的水稻品種與分蘗遲發類型的水稻品種間平均分蘗數一直都有顯著性差異。

表1 水稻不同品種苗期單株分蘗數

2.2 不同水稻品種苗期第1～3 葉位成蘗率

為研究水稻早發分蘗的發生情況，本研究觀察統計了上述12 個水稻品種第1～3 葉位的成蘗率。統計結果如圖1 所示，12 個水稻品種中只有天優華占、揚兩優6 號、岳4B、Y 兩優800 在第1 葉位上長出分蘗，其成蘗率分別為80%、50%、20%、10%。第2 葉位除黃華占、HR901 和鄂早18 成蘗率為0 外，其余水稻品種都形成分蘗且成蘗率都在30% 以上。天優華占、揚兩優6 號、岳4B、明恢63 和Lemont 第2 葉位成蘗率為60%～100%。在第3 葉位上僅有鄂早18 的成蘗率是10%，其余水稻品種的成蘗率都在60% 以上，其中天優華占、揚兩優6 號、岳4B 和明恢63 的成蘗率達100%。

2.3 水稻第1～3葉位成蘗率與分蘗數的相關性分析

圖1 水稻不同品種苗期第1～3 葉位成蘗率

為分析分蘗數與第1～3 葉位成蘗率之間的關系，本研究將12 個水稻品種1～3 葉位成蘗率分別與單株分蘗數進行了相關性分析（表2），由表2 可知，水稻第2、3 葉位成蘗率與分蘗數呈顯著正相關，特別第2 葉位成蘗率與分蘗數之間的正相關性達極顯著水平（P＜0.01），且相關系數高達0.754～0.931。水稻播種后18～34 d 的單株分蘗數與第1 葉位成蘗率之間相關性不顯著，說明第1 葉位成蘗率對單株分蘗數的影響不大。

2.4 水稻第1～3 葉位成蘗率與苗期葉片銨態氮同化酶活性、葉鞘可溶性糖含量的相關性分析

氮素水平是影響水稻分蘗發生的重要因素之一，充足的氮素供應可以促進分蘗［10］，供應不足會導致有效分蘗數大量減少［11］。在生長發育過程中水稻植株從稻田吸收無機氮的主要形式為NH4+，氮素同化酶GS、GOGAT 和GDH 在將無機氮NH4+轉化為有機氮的過程中起著關鍵作用。由表3 可知，第1 葉位成蘗率與GS、NADH-GOGAT 和NADHGDH 的活性均呈顯著正相關，而第2 葉位成蘗率只與NADH-GDH 酶活性呈極顯著正相關（P＜0.01），第3 葉位成蘗率只與NADH-GOGAT 酶活性呈顯著正相關（P＜0.05）。此外，表2 結果還顯示，水稻第1～3 葉位成蘗率均與秧苗葉鞘的可溶性糖含量之間的相關性不顯著。

表2 水稻第1～3 葉位成蘗率與單株分蘗數的相關性分析

2.5 水稻第1～3 葉位成蘗率與分蘗相關基因表達量的相關性分析

由表4 可知，水稻秧苗第1 葉位成蘗率與分蘗芽發育相關基因（MOC1 和OGR1）、IAA 合成相關基因YUCCA6、CK 合成基因IPT5 以及SL 合成及調控通路相關基因（HTD1、D10、D3、D14、IPA1 和TB1）的表達量之間的相關性均不顯著，表明水稻第1 葉位成蘗率基本不受水稻分蘗芽發育和分蘗形成的遺傳調控系統的調控。第2 和第3 葉位的成蘗率均與分蘗芽發育相關基因（MOC1 和OGR1）和CK 合成基因IPT5 的表達量之間相關性不顯著，但分別與IAA 合成相關基因YUCCA6 和SL 合成及調控通路相關的多數基因（HTD1、D10、D3、D14、IPA1 和TB1）的表達量呈顯著或極顯著負相關，表明水稻第2 和第3 葉位成蘗率不受分蘗芽發育的制約，IAA 合成和SL 合成及調控是負調控水稻第2 和第3 葉位成蘗率的主要遺傳基礎。

表3 水稻秧苗第1～3 葉位成蘗率與苗期葉片銨態氮同化酶活性、葉鞘可溶性糖含量的相關性分析

表4 水稻第1～3 葉位成蘗率與秧苗分蘗節分蘗相關基因表達量的相關性分析

3 小結與討論

水稻分蘗是影響水稻產量的重要農藝性狀之一，受水稻植株遺傳基礎及其生長發育環境的共同調控。不論是“超級雜交稻”“超高產新株型”還是“水稻理想株型”，其核心內容都是控制水稻的無效分蘗、提高成穗率，進而提高水稻產量。成穗數是水稻產量的重要構成之一，而單株有效分蘗數又是決定成穗數的重要因素，過低或過高的分蘗數都會影響成穗數和成穗率，進而影響到最終的產量形成［32，33］。在水稻生產中，人們習慣上將成穗率高和穗形較大的分蘗叫做優勢分蘗［34］。優勢的強弱一般是一級分蘗＞二級分蘗＞三級分蘗，同是一級分蘗的，其所處的節位比較低或者出生時間比較早，常常有較高的成穗率，穗形也比較大，因此生產上強調栽后早發分蘗。黃耀祥等［35］提出了水稻的“早發”概念，即早在營養生長前期就長出較為強壯的分蘗，為重穗型遺傳特性的表達和孕育大穗提供了有效保證。蔣彭炎等［36］的“三高一穩栽培法”中也提出要促進早期分蘗的發生。在水稻生產中，低節位（早發）分蘗往往能夠形成有效分蘗，在成熟期其穗部性狀更接近主莖，對植株產量的形成具有重要貢獻。在小麥中，同樣也發現低節位分蘗穗的每穗粒數和每穗可育小穗數更多、每穗不育小穗數更少、千粒重更高，低節位分蘗（早發分蘗）比高節位分蘗（遲發分蘗）具有更高的單穗產量［37，38］。

本研究發現低節位早發分蘗特性在水稻品種資源中具有較大的遺傳變異，受到多種遺傳因素的調控，包括生長素、獨腳金內酯、可溶性糖含量以及氮同化相關酶活性等。水稻莖鞘中可溶性糖含量是決定其總莖蘗數和存活率的重要因素［39］，在本研究中發現葉鞘中可溶性糖與水稻第1～3 葉位成蘗率無顯著相關性，說明在水稻低節位的分蘗芽初步生長階段，對可溶性糖的要求比較低，只要維持低水平的可溶性糖含量水稻就可以形成分蘗芽。生長素合成相關基因的表達水平與水稻第2、3 葉位成蘗率呈極顯著相關，說明在水稻苗期分蘗節中YUCCA6 的表達是影響水稻不同品種低節位分蘗的關鍵因素之一。SLs 能夠抑制植物的分枝和側芽的生長［40］，HTD1、D10 都是SLs 合成途徑上的基因，D14、D3 是SLs 信號傳導過程中的基因，IPA1 和TB1 是SLs 下游調控基因［18-21］，這些基因通過SLs 信號通路抑制水稻側芽向外生長［41，42］。研究還發現低節位成蘗與SLs 信號通路及其下游調控基因IPA1 和TB1 密切相關，第2 葉位成蘗率與D10、D14、IPA1 和TB1 的相對表達量呈顯著相關，第3 葉位成蘗率與HTD1、D14 和TB1 的相對表達量呈顯著相關，第2、3 葉位成蘗率與D3 的相對表達量呈極顯著相關。說明當腋芽處于分蘗原基狀態時，SLs 信號通路上HTD1、D10、D3 和D14 基因以及其下游基因IPA1 和TB1的表達已經開始對苗期低節位分蘗芽的生長起作用。

通過品種改良和栽培調控促進低節位、早發分蘗是水稻高產的重要途徑，本研究為探究影響早發分蘗相關因素提供了更多的理論依據，但更細致的機理還需進一步研究。