實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)食品中熒光假單胞菌方法的建立

閔 可，張 政，周雨蕾，侯溫甫，王宏勛，周 敏

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一種嗜冷菌，革蘭氏陰性菌，一種典型的條件致病菌[1]。可分泌黃綠色熒光色素，產(chǎn)生耐熱的蛋白酶和脂肪酶[2]。 熒光假單胞菌能在冷藏的高蛋白、高脂肪食品中快速大量繁殖，造成嚴(yán)重的腐敗問題[3]；污染血液制品會(huì)導(dǎo)致輸血病人休克[4]；污染奶制品會(huì)影響奶制品的物理品質(zhì)與感官品質(zhì)[5]。在高溫處理后這些酶依舊有活性，影響乳制品品質(zhì)、保質(zhì)期[6]。

目前，關(guān)于熒光假單胞菌的檢測(cè)國(guó)內(nèi)以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、重復(fù)性低。滿足當(dāng)下高通量快速檢測(cè)食品、科研和生產(chǎn)等要求需要更先進(jìn)的技術(shù)。基于分子生物學(xué)的發(fā)展，微生物檢測(cè)技術(shù)也都得到很大提升。Scarpellini等[7]針對(duì)16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)熒光假單胞菌，常被應(yīng)用于檢測(cè)和鑒定熒光假單胞菌。黃迅辰[8]建立以免疫磁珠為基礎(chǔ)的ELISA方法。Liang Xin等[9]基于脂肪酶基因用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)牛奶中的熒光假單胞菌。楊一林等[10]針對(duì)gyrB基因建立了常規(guī)PCR檢測(cè)熒光假單胞菌方法并進(jìn)行評(píng)價(jià)。食品因其成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多樣、各種微生物動(dòng)態(tài)變化含量未知、提取出的模板DNA可能有PCR抑制成分等造成食品微生物檢測(cè)難度增加[11-12]。引物特異性強(qiáng)可鑒別目的菌，降低假陽(yáng)性結(jié)果；引物靈敏度高可在目的菌含量低的情況下也能檢出目的菌；較好的抗干擾能力是食品微生物檢測(cè)實(shí)際應(yīng)用中的要求之一。

TaqMan探針real-time PCR因其耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、靈敏度高被用于食源性致病菌的檢測(cè)[13-15]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)gyrB基因設(shè)計(jì)3 對(duì)引物和探針，并通過(guò)初步特異性驗(yàn)證，篩選1 對(duì)特異性最佳引物和TaqMan探針，建立熒光假單胞菌real-time PCR檢測(cè)體系，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，考察其特異性、靈敏度、抗干擾能力等指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用菌株：熒光假單胞菌11 株，假單胞菌屬其他種類細(xì)菌10 株，非假單胞菌的常見食源性致病菌17 株。標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心、中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心、中國(guó)工業(yè)微生物菌種庫(kù)、中國(guó)檢科院食品安全微生物菌種保藏管理中心，本實(shí)驗(yàn)室分離保存的熒光假單胞菌編號(hào)為AS1。

1.1.2 試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；緩沖蛋白胨水 青島海博生物技術(shù)有限公司；基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 天根生化科技有限公司；Premix ExTaqTM、pMD19-T載體、gyrBF/R、TaqMan探針 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9082恒溫菌種培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化有限公司；SIGMA 3K15高速離心機(jī)、CFX CONNECT BIO-RAD MS-2 real-time PCR儀、ChemiDoc MP BIO-RAD化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、One ND-2000微量核酸蛋白質(zhì)濃度測(cè)定儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)熒光假單胞菌；同時(shí)37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)非熒光假單胞菌的所有菌株。

1.3.2 基因組DNA提取

按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取。

菌體收集：收集1.0 mL菌體，離心后棄上清液。

革蘭氏陽(yáng)性菌裂解方法：加入500 μL緩沖液BS、50 μL溶菌酶充分吸打混勻，37 ℃水浴溫育60 min，12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。加入180 μL緩沖液GL、20 μL的蛋白酶K和10 μL核糖核酸內(nèi)切酶充分吸打混勻，56 ℃水浴溫育10 min。加入200 μL緩沖液GB和200 μL純乙醇并混勻。革蘭氏陰性菌裂解方法：加入180 μL緩沖液GL、20 μL蛋白酶K和10 μL核糖核酸內(nèi)切酶充分振蕩混勻。56 ℃水浴消化裂解10 min，分別加入200 μL的緩沖液GB、純乙醇，再充分混勻。

將Spin Column安裝在Collection Tube上，溶液移至Spin Column柱中，12 000 r/min離心2 min，棄濾液。將500 μL的緩沖液WA加到柱內(nèi)，12 000 r/min離心2 min后棄濾液，重復(fù)1 次。加入80 μL重蒸水，靜止5 min后離心得基因組DNA，于4 ℃保存。

1.3.3 引物與TaqMan探針的設(shè)計(jì)

使用軟件Primer express 3.0，以熒光假單胞菌AS1.823的gyrB基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)檢測(cè)引物和探針，結(jié)果如表1所示。

表1 引物和探針序列信息Table 1 Sequences of the primers and probes used in this study

1.3.4 real-time PCR體系組成與反應(yīng)條件

表2 PCR體系組成Table 2 Composition of the PCR reaction system

PCR體系組成如表2所示。real-time PCR程序參數(shù)：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)36 次。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以10 倍梯度稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并取每個(gè)梯度5 μL作為real-time PCR擴(kuò)增的模板，重復(fù)3 次。標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增得到的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Ct值），DNA模板量的對(duì)數(shù)（lgC）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 real-time PCR檢測(cè)體系評(píng)價(jià)

1.3.6.1 特異性評(píng)價(jià)

提取所有菌株基因組DNA，以雙蒸水為空白對(duì)照，采用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)所有菌株檢測(cè)進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增。如果Ct值小于35，判斷檢出結(jié)果為陽(yáng)性。

1.3.6.2 靈敏度評(píng)價(jià)

基因組DNA靈敏度評(píng)價(jià)：使用試劑盒提取熒光假單胞菌（AS1.823）基因組DNA。將基因組DNA進(jìn)行10 倍梯度稀釋后測(cè)定核酸濃度，對(duì)每個(gè)稀釋度分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)梯度重復(fù)3 次，能得到明顯擴(kuò)增曲線的最低濃度梯度即為real-time PCR檢測(cè)體系靈敏度。

如在強(qiáng)化學(xué)生關(guān)于側(cè)面描寫和正面描寫兩種寫作技巧時(shí)，筆者選取了《口技》一文作為講解范例，筆者讓學(xué)生在已經(jīng)理解文意的基礎(chǔ)上再次閱讀，并根據(jù)“夢(mèng)中驚醒”“漸入夢(mèng)鄉(xiāng)”和“火起群亂”三方面梳理文章的寫作順序，剖析該文章描寫技巧的使用，而在學(xué)生對(duì)側(cè)面描寫與正面描寫有所認(rèn)知后，筆者又布置了與之相關(guān)的“音樂”描寫，并讓學(xué)生在寫作過(guò)程中采用側(cè)面描寫與正面描寫兩種寫作技巧，使得學(xué)生所掌握的理論知識(shí)能夠快速有效地與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)結(jié)合，真正提升其寫作水平。

純培養(yǎng)物水平靈敏度檢測(cè)：熒光假單胞菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇10-6、10-7和10-8這3 個(gè)稀釋倍數(shù)的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。提取基因組DNA，以ddH2O為空白對(duì)照，分別進(jìn)行real-time PCR，重復(fù)3 次。

1.3.6.3 抗干擾能力評(píng)價(jià)

選取類產(chǎn)堿假單胞菌（P. pseudoalcaligenesIQCC12603）、門多薩假單胞菌（P. mendocinaCICC21629）、惡臭假單胞菌（P. putidaCICC21884）、銅綠假單胞菌（P. aeruginosaIQCC12625）4 株干擾菌，與熒光假單胞菌分別培養(yǎng)至穩(wěn)定期，1 0 倍梯度稀釋后，選擇平板計(jì)數(shù)法得到菌量。將4 種干擾菌混合，設(shè)置1 04、1 06、1 083 個(gè)干擾濃度，與熒光假單胞菌不同梯度稀釋液（1 0-4～ 10-10）分別混合，以不加入熒光假單胞菌的干擾菌混合液為空白對(duì)照，在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，于第0小時(shí)和第15小時(shí)分別取樣1 次，使用試劑盒提取基因組DNA，分別進(jìn)行real-time PCR。

1.3.6.4 樣品接菌檢測(cè)驗(yàn)證

選取熒光假單胞菌菌液接入NB培養(yǎng)基中，放置于搖床28 ℃、150 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期，10 倍梯度稀釋，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。向225 mL選擇性增菌液中接入25 mL全脂滅菌純牛奶，分別接入0.1～1、1～10、10～100 CFU/mL 3 個(gè)梯度的菌液1 mL平行3 次，于0～24 h內(nèi)每隔3 h取樣一次，試劑盒提取基因組DNA，分別進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，以無(wú)菌水為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針的篩選與特異性評(píng)價(jià)

表3 菌種編號(hào)及特異性檢測(cè)結(jié)果Table 3 Strains used in specificity evaluation of PCR

使用常規(guī)PCR初步篩選引物，得出引物gyrB8-1特異性最好。再通過(guò)real-time PCR特異性篩選，得出探針gyrB TaqMan1效果最好。利用引物gyrB8-1、探針gyrB TaqMan1對(duì)所有實(shí)驗(yàn)菌株分別進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。以熒光假單胞菌的基因組DNA為模板時(shí)，擴(kuò)增Ct值均小于35，而以非熒光假單胞菌基因組DNA為模板則未出現(xiàn)PCR擴(kuò)增。與常規(guī)PCR比較，基于TaqMan探針的real-time PCR方法采用了特異探針可識(shí)別目的片斷，與擴(kuò)增引物的特異性相疊加，且回避了分析擴(kuò)增產(chǎn)物大小來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，可有效增強(qiáng)體系的特異性；不需在擴(kuò)增結(jié)束后分析熔解曲線，更縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)[17]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照本實(shí)驗(yàn)制得的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒D N A 質(zhì)量濃度為 3.55 ng/μL，換算為9.58×109copies/μL，根據(jù)1.3.5節(jié)方法單獨(dú)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到y(tǒng)=-0.235 9x＋11.053，相關(guān)系數(shù)R2為0.99，表明該曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，本體系擴(kuò)增效率很好。

圖1 熒光假單胞菌定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of real-time PCR

2.3 靈敏度評(píng)價(jià)

提取出的DNA初始質(zhì)量濃度為1.43×104fg/μL，以10 倍梯度稀釋，最小質(zhì)量濃度為1.43×10-2fg/μL。如表4所示，在基因組DNA模板的終質(zhì)量濃度為14.3 fg/μL（2～3 copies/μL）時(shí)，3 個(gè)平行都能讀出Ct值。而當(dāng)模板終質(zhì)量濃度為1.43 fg/μL時(shí)，3 個(gè)平行中只有1 個(gè)能讀出Ct值，說(shuō)明該real-time PCR檢測(cè)體系的擴(kuò)增靈敏度為14.3 fg/μL。

表4 DNA質(zhì)量濃度與值關(guān)系（AS1.823）Table 4 Relationship between DNA concentration and Ct (AS1.823)

將培養(yǎng)12 h的熒光假單胞菌AS1.823進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，算得起始菌液濃度為3.0×109CFU/mL。如表5所示，在稀釋度為10-7時(shí)3 個(gè)平行都能讀出Ct值，而在稀釋度為10-8時(shí)3 個(gè)平行都不能讀出Ct值，則該real-time PCR檢測(cè)體系的純培養(yǎng)物水平靈敏度為3.0×102CFU/mL。

表5 純培養(yǎng)物濃度與Ct值關(guān)系（AS1.823）Table 5 Relationship between pure culture of AS1.823 and Ct

2.4 抗干擾能力評(píng)價(jià)

熒光假單胞菌和類產(chǎn)堿假單胞菌（IQCC12603）、門多薩假單胞菌（CICC21629）、惡臭假單胞菌（CICC21884）、銅綠假單胞菌（IQCC12625）4 株干擾菌活化后分別培養(yǎng)至穩(wěn)定期，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算得到起始菌液濃度分別為1.4×109、5.7×108、3.4×109、4.5×109、6.0×108CFU/mL。如表6所示，添加低濃度約1.4×104CFU/mL的干擾菌純培養(yǎng)物時(shí)，不影響本實(shí)驗(yàn)real-time PCR檢測(cè)體系的靈敏度，而添加高濃度約5.6×108CFU/mL的干擾菌純培養(yǎng)物時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中real-time PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)限下降到3.0×103CFU/mL。楊一林等[10]建立的常規(guī)PCR檢測(cè)方法靈敏度為3.0×104CFU/mL。 說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物gyrB8-1探針gyrB TaqMan1 real-time PCR方法與常規(guī)PCR系統(tǒng)相比較具有更強(qiáng)的抗干擾能力。在實(shí)際的食品微生物檢測(cè)中，樣品自帶的各種微生物會(huì)形成干擾，檢測(cè)體系的抗干擾能力強(qiáng)有助于檢測(cè)方法的實(shí)際推廣。從這一角度看，TaqMan探針法熒光定量體系更適合實(shí)際檢測(cè)[18-19]。

表6 添加干擾菌情況下對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響Table 6 Effect of adding interfering bacteria on the sensitivity of PCR

2.5 樣品接菌檢測(cè)驗(yàn)證

將濃度為22、2.2、0.22 CFU/mL的菌液按照1.3.6.4節(jié)的操作方法加入全脂滅菌純牛奶，每個(gè)濃度3 組平行，0～24 h每隔3 h取樣1 次進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。如表7所示，當(dāng)接入22 CFU/mL的熒光假單胞菌，增菌12 h可檢測(cè)到熒光假單胞菌；當(dāng)接入2.2 CFU/mL的熒光假單胞菌，增菌15 h檢測(cè)呈陽(yáng)性；接菌量為0.22 CFU/mL、增菌24 h后僅有1 組被檢出。實(shí)驗(yàn)表明適當(dāng)?shù)脑鼍蓭椭鷻z出熒光假單胞菌。

表7 人工污染樣品的PCR檢測(cè)結(jié)果Table 7 Results of PCR detection of artificial contamination

3 討 論

熒光假單胞菌的快速檢測(cè)對(duì)食品工業(yè)和公眾健康至關(guān)重要。雖然熒光假單胞菌對(duì)健康人不具有致病性，日常烹飪加熱即可殺死，但隨著冰箱的普及，人們對(duì)奶、肉制品的需求增多，食用涼拌食品，熒光假單胞菌比以往更能威脅公眾健康[20]。

分子生物學(xué)的發(fā)展為食品檢測(cè)提供了新的檢測(cè)方法，相比傳統(tǒng)檢測(cè)方法，分子生物學(xué)方法擁有傳統(tǒng)檢測(cè)方法達(dá)不到的優(yōu)勢(shì)[21]。聚合酶鏈反應(yīng)衍生出一系列的新技術(shù)，例如real-time PCR、變性梯度凝膠電泳、多重PCR、巢式PCR、免疫PCR、熱啟動(dòng)PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增等，這些先進(jìn)的方法已被用于病原體、致病微生物、寄生蟲、比病理檢測(cè)等[22-24]。

通過(guò)監(jiān)視插入染料、熒光標(biāo)記引物或序列特異性探針產(chǎn)生的熒光，real-time PCR可在整個(gè)熱循環(huán)過(guò)程中的計(jì)算機(jī)屏幕上觀察每個(gè)DNA擴(kuò)增周期。特異性探針有助于提高特異性、提高靈敏度，real-time PCR檢測(cè)的好處超過(guò)傳統(tǒng)的端點(diǎn)檢測(cè)方法包括動(dòng)態(tài)范圍大，交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)降低，可擴(kuò)展以用于高通量應(yīng)用，并有可能精確目標(biāo)量化[25]。 而real-time PCR另一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是不需要瓊脂糖凝膠電泳可視化擴(kuò)增的目標(biāo)DNA，這大大縮短了分析時(shí)間[26]。

本研究基于前人基礎(chǔ)，選擇熒光假單胞菌特異靶位點(diǎn)gyrB基因[27]，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA濃度與Ct值呈良好線性關(guān)系，R2=0.99，設(shè)計(jì)的引物與探針對(duì)除熒光假單胞菌以外的假單胞菌、常見食源性致病菌均無(wú)擴(kuò)增、沒有假陽(yáng)性、特異性好，與高琳等[28]建立基于gyrB基因以及apr基因的食品中熒光假單胞菌雙重PCR檢測(cè)方法比較，得出靈敏度為16.9 fg/μL，本實(shí)驗(yàn)在基因組DNA方面評(píng)價(jià)靈敏度為14.3 fg/μL，且本實(shí)驗(yàn)做了不同濃度純培養(yǎng)物提取DNA檢測(cè)靈敏度，結(jié)果為3.0× 102CFU/mL。考慮到實(shí)際檢測(cè)中樣品含未知的不同病原菌，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了添加4 種假單胞菌屬的其他菌作為干擾菌評(píng)價(jià)本檢測(cè)方法的抗干擾能力，結(jié)果表明低干擾菌存在下對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，高濃度干擾菌添加組經(jīng)過(guò)15 h增菌檢測(cè)限依舊可達(dá)到3.0×103CFU/mL，依然比常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法快速。

檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)已取得長(zhǎng)足發(fā)展，各種先進(jìn)方法都在為食品安全、人民健康保駕護(hù)航。在熒光假單胞菌檢測(cè)以及其他病原微生物檢測(cè)中仍有許多目標(biāo)沒有達(dá)到，比如滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、進(jìn)一步提高檢測(cè)速度、實(shí)驗(yàn)儀器微型化降低成本、提高實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性、減少假陽(yáng)性等[29-30]。2 種及以上的分子檢測(cè)手段聯(lián)合使用可提高檢測(cè)速度同時(shí)保證分析的準(zhǔn)確性[31]，將是未來(lái)檢測(cè)熒光假單胞菌的研究方向。

4 結(jié) 論

本研究基于引物gyrB8-1、探針gyrB TaqMan1建立real-time PCR法，可特異性檢測(cè)熒光假單胞菌；基因水平擴(kuò)增靈敏度為14.3 fg/μL；添加低濃度非熒光假單胞菌，干擾濃度添加高濃度約5.6×108CFU/mL時(shí)，檢測(cè)限下降到3.0×103CFU/mL；熒光假單胞菌22 CFU/mL污染樣品，增菌12 h，對(duì)熒光假單胞菌的檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。本檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、抗干擾性好、檢測(cè)限低，可縮短檢測(cè)周期、節(jié)約試劑與人力成本、符合大批量檢測(cè)要求，可用于快速檢測(cè)熒光假單胞菌。