黃曲霉毒素B1核酸適配體篩選和檢測方法的建立

張 敏，張先舟，李 聰，高 浩，劉健慧，田益玲，馬 雯，李英軍，檀建新

（河北農業大學食品科技學院，河北省農產品加工工程技術中心，河北 保定 071000）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是真菌毒素中毒性最強的一種化合物，具有與蛋白質和DNA結合的“雙重危險”能力，有致突變和致癌毒性，可引起多種疾病，如肝癌、腦病、肺間質纖維化以及生殖和免疫系統疾病等，被世界衛生組織列為人類第一類致癌物[1-3]。這些真菌可以污染不同食物，如干果（無花果和葡萄干）、谷物（大米、玉米、大麥）、水果和咖啡等[4-5]。大多數動物的半數致死量（LD50）在1～50 mg/kg之間，對于一些敏感的動物，如家禽、虹鱒魚和大鼠，其臨界毒性水平低于1 mg/kg[6]。如果動物誤食含黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1， AFB1）污染的飼料，經肝臟轉化產生羥化代謝物AFM1，在哺乳動物乳腺中，隨乳汁排出，危害動物健康，同時也嚴重影響奶制品的質量和安全[7]。

核酸適配體是通過指數富集的配體系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術[8]，經過多輪篩選后，從隨機單鏈寡核苷酸（single-strand DNA，ssDNA）或ssRNA分離得到與靶標分子高親和力、特異性結合寡核苷酸序列，并能通過分子間的相互作用（如芳香環、π-π堆積、范德華力和帶電基團之間的靜電相互作用等）形成特殊的三維結構[9-10]。在1990年，Ellington[11]和Tuerk[12]等首次提出核酸適配體的概念。Ellington等[11]報道了一組與有機染料的特異性RNA適配體，Tuerk等[12]報道了一種與T4 DNA聚合酶相互作用的RNA適配體。適配體的靶標范圍廣泛，從小分子的金屬離子、有機染料到生物大分子，如蛋白質、細胞甚至整個腫瘤組織[13-14]。與抗體相比，適配體具有生產方便、成本低、熱穩定好、易化學合成、易與多種官能團修飾、高親和合力和高特異性等優點[15-16]，在分析領域具有廣闊的應用前景。目前靶向生物毒素適配體陸續有報道，包括特異性識別葡萄球菌腸毒素[17]、赭曲 霉素[18]、T-2毒素[19]、伏馬毒素[20]和玉米赤霉烯酮[21]。以適配體為識別元件，所開發的生物傳感器具有更高的靈敏度和特異性，檢測時間短，可在現場檢測等優點[22]。

經過近30年的發展，根據不同的靶標已經陸續發展了很多篩選方法。目前篩選小分子物質一般采用磁珠法、親和層析柱法、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）法[23-25]。在篩選AFB1時，因其無任何功能性官能團，難以共軛，給篩選帶來一定的難度。如果采用傳統磁珠法，還有可能改變靶標的構象和性質，影響適配體親和力等一系列的問題[26]。Gao Sunxiang等[27]針對海洋生物毒素膝溝藻毒素1/4進行兩種不同篩選方法，一種采用傳統的磁珠法（magnetic beads-SELEX，MB-SELEX），另一種采用新型的氧化石墨烯法（GO-SELEX），結果發現與典型的MB-SELEX相比，GO-SELEX更具有優勢。首先，GO-SELEX過程中，ssDNA每輪的回收率顯著高于MB-SELEX；其次，通過GO-SELEX獲得的序列顯示更高同源性，其中具有多個重復序列，而MB-SELEX獲得的序列具有較低同源性，幾乎沒有重復序列；最后GO-SELEX篩選的適配體解離常數Kd在納摩爾每升范圍內，表現出更高的親和力，而MB-SELEX具有較低的親和力，范圍從幾十微摩爾每升到幾微摩爾每升，差距可達100 倍。

國內外已建立了多種針對AFB1的檢測方法，主要包括薄層色譜法[28]、高效液相色譜法[29]、酶聯免疫法[30]、膠體金免疫層析技術[31]和免疫親和柱熒光[32]檢測等，以上這些方法的應用受到檢測儀器昂貴、檢測過程繁瑣且需要專門的操作人員等其他原因的限制。而納米金比色方法具有檢測方便、靈敏、適應性強、低成本、可短時間分析等優勢，在食品安全的快速檢測中越來越受到歡迎。

本實驗利用GO-SELEX法將靶物質AFB1和一個長度為80 bp的隨機ssDNA文庫進行孵育，以GO作為分離物質，以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增和磁珠法制備次級文庫為手段，通過8 輪正篩選和2 輪反篩選，獲得高親和性和高特異性的核酸適配體序列，為小分子DNA適配體的篩選提供一種新的替代方法，并以篩選所得的適配體為特異性識別探針，納米金為指示劑，建立AFB1的可視化檢測方法，以期為食品安全檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米 保定永輝超市；A F B1、伏馬菌素（fumonisin B1，FB1）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A， OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素 青島普瑞邦生物工程有限公司；GO 上海阿拉丁試劑有限公司；2×Es Taq Master Mix（Dye）、50 bp DNA ladder 北京康為世紀生物科技有限公司；核酸共沉劑試劑盒、pMD18-T連接試劑盒 大連寶生物工程有限公司；鏈霉親和素磁珠 蘇州海貍生物醫學工程有限公司；Top10大腸桿菌感受態、提取質粒試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑 北京Solarbio 公司；氯金酸（HAuCl4） 美國Sigma公司；二水合檸檬酸三鈉、NaCl、HCl、HNO3上海國藥集團化學試劑有限公司。

適配體庫：DNA （ssDNA ）文庫：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAG-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGA-3’，上游引物P1：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAG-3’，下游引物P2：5’-TCAAGAGGTAGACGCACATA-3’。標記的下游引物P3：5’-biotin-TCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

TG16-WS微量高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；JY04S-3C聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置 北京君意華鑫科技有限公司；TProfessional standard PCR儀 德國Biometra公司；DYY-7C電泳儀 北京市六一儀器廠；WD9413C凝膠成像分析系統 北京科普爾科技發展有限公司；iMark酶標儀 美國Bio-Rad公司；K2800核酸蛋白儀 北京凱奧科技發展有限公司；KQ-500DV超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DFY-500高速粉碎機 浙江省永康市金穗機械制造廠。

1.3 方法

1.3.1 SELEX過程

1.3.1.1 正向篩選

1）取2 nmol的初始文庫（合成的ssDNA文庫）溶解于400 μL結合緩沖液，混合均勻，于95 ℃水浴熱變性10 min，0 ℃冰浴10 min，室溫10 min。加入2 nmol靶標AFB1，室溫孵育1 h。

2）加入GO溶液，4 ℃、13 000 r/min多次離心，去除上清液，將上述孵育混合液轉移到GO沉淀，孵育2 h。

3）4 ℃、13 000 r/min離心10 min，棄除沉淀，收集上清液，并通過苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）混合液抽提，12 000 r/min離心5 min，吸取上層水相，并加入1/10 倍體積的3 mol/L醋酸鈉（pH 5.2）溶液，2.5 倍體積的冰乙醇溶液混勻，-20 ℃靜置過夜。

4）4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，再加入4 ℃預冷的70%乙醇溶液洗滌后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。沉淀部分室溫干燥，加入100 μL滅菌TE緩沖溶液，通過核酸蛋白儀測定濃度。

1.3.1.2 反向篩選

1）用400 μL的結合緩沖液溶解ssDNA文庫，于95 ℃熱變性10 min，0 ℃ 10 min，室溫10 min。加入等物質的量的ZEN、DON、T-2毒素、FB1和OTA混合液，室溫輕微振蕩孵育1 h。

2）加入GO溶液，4 ℃、13 000 r/min多次離心，去除上清液，將上述孵育混合液轉移到GO沉淀，孵育2 h。

3）4 ℃、13 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，得到GO-ssDNA沉淀，加入400 μL的結合緩沖液將其重懸，離心，棄上清液，重復操作3 次，以便徹底去除與反篩物結合的適配體。

4）經過洗滌沉淀后，重新加入400 μL結合緩沖液和2 nmol AFB1溶液，室溫孵育1 h。

5）4 ℃、12 000 r/min離心15 min，上清液通過苯酚、氯仿和異戊醇抽提，乙醇法沉淀，加入100 μL滅菌TE緩沖溶液重溶DNA，通過核酸蛋白儀測定濃度。

1.3.1.3 ssDNA的PCR條件優化

用于擴增ssDNA的PCR擴增體系如下：DNA模板2.0 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，2×Es Taq Master Mix（Dye）12.5 μL，用無菌ddH2O補至25 μL。PCR擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min。擴增產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增結果。

1.3.1.4 ssDNA次級文庫的制備

取100 μL鏈霉親和素修飾過的磁珠，用磁珠緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、1 mol/L NaCl、0.01 %～0.1% Tween-20，pH 7.5）清洗3 遍，加入500 μL的磁珠緩沖液和待分離的雙鏈DNA，室溫振蕩孵育45 min，將其放置于磁力架上，靜置2 min，吸棄上清液。用磁珠緩沖液清洗3 遍后，加入125 μL的0.15 mol/L NaOH溶液，37 ℃孵育15 min，使雙鏈DNA解鏈。吸取上清液，用稀鹽酸溶液調整pH 7.5左右，即可用作次級文庫的下一輪篩選。

1.3.1.5 回收率實驗

每一輪篩選經過醇沉之后計算回收率，隨著篩選輪數的增加，未能與AFB1結合的不斷被篩掉，與AFB1親和力高的ssDNA逐漸得到富集，回收率不斷增加，待回收率趨于平穩，篩選過程基本結束。

1.3.2 連接轉化及適配體二級結構的預測

將第8輪和終輪篩選得到的ssDNA，用上游引物P1和下游引物P3進行PCR擴增，擴增產物全量上樣于3%瓊脂糖，電泳并切下目的條帶，通過DNA回收試劑盒進行ssDNA回收。將PCR產物與pMD18-T載體連接，連接轉化到大腸桿菌感受態，振蕩培養45 min，使細菌復蘇，37 ℃過夜培養。經菌落PCR驗證，隨機挑取60 個陽性克隆子轉接到液體LB培養基中，培養12 h，用質粒提取試劑盒提取質粒，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

將測序序列結果經過比對，去除重復和非單克隆的序列，用DNAMAN軟件在線預測模擬二級結構。

1.3.3 適配體與AFB1的親和力驗證

將不同濃度（5～200 nmol/L）熒光標記的適配體序列進行95 ℃加熱，立即0 ℃冰浴的預處理，分別與固定濃度AFB1（1 μmol/L）室溫孵育2 h，反應總體積為500 μL，同時設置不加入AFB1的陰性對照，孵育結束后，加入與適配體呈比例的GO溶液，繼續避光孵育60 min，13 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL放入黑色酶標板中，用酶標儀測定熒光值（Ex=480 nm，Em=520 nm）。采用GraphPad-Prism6軟件將熒光值對應核酸適配體濃度進行非線性擬合，根據公式：Y=Bmax×X/（Kd＋X）計算得到Kd值（Bmax為最大結合位點的數目， X為適配體濃度，Y為熒光強度）。

1.3.4 適配體與AFB1的特異性驗證

通過比較每條適配體序列的Kd值，挑選親和力較高的適配體序列進行特異性分析實驗。具體操作步驟為：將100 nmol/L帶FAM標記的序列分別加入ZEN、DON、T-2毒素、FB1、OTA和AFB1（各1 nmol），37 ℃孵育2 h后，再加入GO溶液（GO∶ssDNA=400∶1）進行吸附，37 ℃搖床孵育1 h，以猝滅未結合AFB1適配體序列的熒光。反應結束后，將孵育混合物以 13 000 r/min離心10 min，并收集上清液，測定上清液的熒光值（Ex=480 nm，Em=520 nm）。

1.3.5 納米金粒子比色法檢測AFB1

1.3.5.1 納米金的制備

納米金采用Frens[33]建立的檸檬酸鈉還原法制備。在燒杯中加入95.8 mL純水，再加入4.2 mL質量分數1%氯金酸溶液，加熱至沸騰，迅速加入10 mL質量分數1%檸檬酸鈉溶液，繼續加熱20 min至沸騰，然后通過連續攪拌將溶液冷卻至室溫，得到的酒紅色液體為納米金溶液。通過紫外-可見光譜進行表征。

1.3.5.2 NaCl濃度的優化

在100 μL納米金溶液中，加入10 μL不同濃度的NaCl溶液混合，靜置10 min，整個反應都在室溫下進行，觀察溶液顏色變化并測定其A520nm值。

1.3.5.3 適配體濃度的優化

在100 μL納米金溶液加入10 μL不同濃度的適配體溶液混合，37 ℃搖床中孵育3 h，最后加入10 μL 750 mmol/L濃度的NaCl溶液，觀察溶液顏色變化并測定其A520nm值。

1.3.5.4 AFB1的檢測

在100 μL納米金溶液加入10 μL 2 μmol/L濃度AFB1適配體，37 ℃搖床孵育3 h，再加入不同濃度的AFB1標準樣品孵育1 h，再加入10 μL 750 mmol/L濃度的NaCl溶液，觀察溶液顏色變化并測定其A520值。

1.3.5.5 特異性的檢測

為驗證本實驗方法的選擇性，分別選取4 ng/μL的AFB1、FB1、OTA、ZEN、DON和T-2毒素，進行檢測，觀察溶液中顏色變化并測定其A650nm/A520nm值。

1.3.5.6 大米樣品中AFB1的加標回收測定

將市售的大米樣品，經過粉碎研磨，取20 g于錐形瓶中，加標后加入100 mL甲醇溶液（體積分數55%），在45 ℃水浴恒溫振蕩器上振蕩1 h。振蕩之后，先用定性濾紙過濾，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，轉移至棕色容量瓶。按實驗方法（1.3.5.4節）測定吸光度和計算回收率，實驗重復測定5 次。同時取上清液用GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》中的第二法 高效液相色譜-柱前衍生法進行衍生處理、檢測和計算回收率。

1.4 數據處理與統計

采用Origin軟件和GraphPad-Prism6軟件進行統計處理。

2 結果與分析

2.1 SELEX的適配體篩選與回收率

本實驗基于GO可通過π-π共軛吸附ssDNA，而對已結合靶標的ssDNA吸附能力較弱的特性，設計針對AFB1核酸適配體的篩選方案。圖1為各輪篩選得到與AFB1結合的ssDNA的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖1 每輪PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Electrophoretograms of PCR products from every round of SELEX

在SELEX篩選過程中，每一輪ssDNA都經過苯酚、氯仿、異戊醇抽提和乙醇沉淀法回收，用核酸蛋白儀測定ssDNA濃度。如圖2所示，前兩輪篩選的回收率不高，可能是因為剛開始隨機文庫數量龐大，與AFB1結合的ssDNA占總體比例較少。隨著篩選輪數的增加，能與AFB1結合的ssDNA也不斷增加。經過10 輪的篩選，能與AFB1結合的ssDNA已趨于飽和，能從隨機文庫中回收一半以上的ssDNA，因此第10輪結束篩選過程。

圖2 SELEX每輪篩選所得的結合AFB1的ssDNA回收率Fig. 2 Recovery of AFB1-bound ssDNA after each round of SELEX

2.2 PCR擴增體系退火溫度和循環次數的優化

本實驗對退火溫度進行優化，設定55、58、61.6、65.2、70 ℃五個退火溫度，如圖3所示，當退火溫度為65.2 ℃時，目的條帶單一且明亮，無非特異擴增產物，以此作為最佳的退火溫度。

圖3 PCR退火溫度的優化Fig. 3 Optimization of annealing temperature for PCR

本實驗固定退火溫度為65 ℃，同時設置16、18、20、22、24、26六個循環次數，如圖4所示，當循環次數為24時，目的條帶顏色厚重且條帶單一，可作為最佳PCR循環次數。

圖4 65 ℃條件下循環次數對PCR的影響Fig. 4 Effect of number of PCR cycles on amplified products at annealing temperature of 65 ℃

2.3 適配體克隆、測序及序列分析

表1 第8輪核酸適配體序列Table 1 Aptamer sequences obtained from the eighth round of screening

在第8輪和第10輪中隨機挑取的60 個單克隆菌落經測序后利用DNAMAN軟件對序列進行分析，其中除去非單克隆序列和錯誤序列后從中共挑選出45 條核酸適配體序列進行下一步的詳細分析，其中第8輪共得到23 條序列，命名為Seq.1～Seq.23，第10輪共得到22 個序列，命名為AFB-1～AFB-22。序列結果如表1、2所示。

表2 第10輪核酸適配體序列Table 2 Aptamer sequences obtained from the tenth round of screening

2.4 適配體的親和力分析

采用熒光分析法測定候選適配體序列與AFB1親和力。Kd值越小代表與靶標的親和力越高，由表3可知，這6 條適配體序列的Kd值在16～47 nmol/L之間，表明適配體對AFB1親和性較高。6 條核酸適配體所涉及的飽和曲線如圖5所示，在適配體濃度為100 nmol/L時，熒光強度也趨于平穩，結合反應達到飽和。

表3 挑選出的6 條AFB1適配體的解離常數Table 3 Dissociation constants of six selected AFB1 aptamers

圖5 AFB1適配體的連接飽和曲線Fig. 5 Binding saturation curves of the selected aptamers to AFB1

2.5 適配體的特異性分析

選取親和力較高的AFB-5和AFB-8進行特異性實驗，如圖6所示，兩條候選適配體在AFB1溶液體系中明顯具有更高的相對熒光強度，顯示這兩條適配體均能特異性結合靶標AFB1。通過比較，序列AFB-8特異性最好。這一結果說明通過兩輪的反篩，降低了對ZEN、DON、T-2毒素、FB1和OTA的結合力。

圖6 AFB-5和AFB-8對不同毒素的相對結合力Fig. 6 Relative binding abilities of AFB-5 and AFB-8 to different toxins

2.6 納米金粒子比色法檢測AFB1

2.6.1 NaCl和適配體濃度的優化

合適的NaCl濃度能降低背景的干擾值，從而提高檢測的靈敏度。如圖7所示，隨著NaCl濃度的增加，納米金顏色由紅色逐漸變紫色最后變為藍灰色。納米金溶液在150 mmol/L濃度的NaCl溶液中幾乎不團聚，肉眼看不出差別，仍保持穩定的紅色，但通過紫外-可見吸收光譜可得出A520nm的值降低，當NaCl濃度為300～750 mmol/L， 納米金溶液開始出現團聚，顏色也逐漸加深，且在520 nm波長處的吸光度也不斷下降，直到在750 mmol/L處趨于平緩。根據紫外-可見吸收光譜和顏色變化最終選擇750 mmol/L為最佳鹽濃度。

圖7 在520 nm波長處的吸光度變化Fig. 7 Changes in absorbance value at 520 nm

適配體在一定程度上可以保護納米金在高鹽條件下聚沉，但也不是適配體的量越多越好。若吸附納米金的適配體量過多，將導致納米金在高鹽濃度溶液中不團聚變色，使整個體系中顏色變化受到影響。如圖8所示，當適配體濃度為1 μmol/L時，納米金處于團聚狀態，適配體不能阻止鹽誘導的聚集，當適配體濃度為2 μmol/L時，納米金變為紅色，說明對納米金鹽誘導保護效果較好，相應的A520nm出現增大的趨勢，且在濃度2 μmol/L以后A520nm值趨于平穩，適配體結合納米金已經飽和。故選擇適配體濃度 2 μmol/L做后續實驗。

圖8 最適適配體濃度的篩選Fig. 8 Selection of the optimal concentration of aptamer

2.6.2 線性范圍和檢出限

將納米金溶液與適配體進行孵育，然后加入不同質量濃度的AFB1溶液，最后加入高濃度的NaCl溶液。如圖9所示，通過紫外-可見吸收光譜可得，隨著AFB1質量濃度的增大，A520nm值逐漸降低。再通過A520nm值繪制AFB1標準曲線，其線性回歸方程為y=-0.007 09x＋0.461 42，R2=0.997 9，線性范圍為0.025～10 ng/mL，檢測限為0.025 ng/mL。

圖9 不同AFB1質量濃度下納米金紫外-可見吸收圖譜Fig. 9 UV-visible absorption spectra of AuNPs at different concentrations of AFB1

2.6.3 特異性分析

分別選取質量濃度為4 ng/mL的AFB1、FB1、OTA、ZEN、DON和T-2毒素進行測定。如圖10所示，該方法在測定除AFB1外的5 種毒素時A650nm/A520nm的值變化較小，故特異性較好。

圖10 核酸適配體的特異性檢測結果Fig. 10 Specificity evaluation of nucleic acid aptamers

2.6.4 大米樣品中AFB1加標回收實驗

將經過預處理的大米樣品中分別加入不同質量濃度的AFB1標準溶液進行檢測，根據與標準曲線數據比對，計算加標回收率，每個添加水平設置平行實驗。同時用高效液相色譜法對相同樣品進行檢測。如表4所示，本實驗構建的AFB1檢測方法與傳統高效液相色譜法相比，結果相差不大，表明本檢測方法具有可行性。

表4 大米樣品中AFB1的檢測回收率（n=5）Table 4 Recoveries of AFB1 in spiked rice samples (n= 5)

3 討論與結論

AFB1相對分子質量僅為312.27，且不具備任何活性基團，用離心沉淀法和毛細管電泳等傳統篩選方法不能將靶標物質與適配體分離出來，大大增加了篩選難度。本實驗采用GO的SELEX篩選方法，無需將AFB1做任何修飾，避免繁瑣的活化固定過程，同時還能保持其完整結構，不會影響適配體的親和力，為篩選適配體提供了簡單、快速的方法，有效地降低了篩選成本，縮短了篩選時間。目前采用此篩選方法已獲得岡田酸[34]、T-2毒 素[35]、棒曲霉素[36]、玉米赤霉烯酮[37]、氧氟沙星[38]、重金屬砷[39]等高親和性高特異性適配體序列。

迄今為止有關AFB1特異性適配體序列報道不多，僅有楊朝勇等[40]基于瓊脂糖微株分離-流式細胞術分析的親和SELEX方法篩選制備和王文鳳[41]采用磁珠負篩SELEX技術篩選得到。但兩種方法都先需要將靶標固定在瓊脂糖微珠或氨基化的磁珠上，都涉及一系列復雜的化學反應，還可能因改變其原有結構以及固相載體的空間位阻效應而影響適配體的篩選效果[42]。

在篩選過程另一大難點就是消除非特異干擾，出現非特異性擴增一方面可能是因為PCR條件不理想，如退火溫度太低、擴增循環輪數太多；另一方面很可能是因為PCR體系混有了GO，雖然在篩選過程中，盡可能地多次離心，去除GO沉淀，但是還是有少量GO混雜在模板中，參與了PCR擴增。經查閱參考文獻，證實這一推測，魏曉磊[43]研究證明，GO可能會結合到TaqDNA聚合酶上，降低酶的活性，或是與DNA模板本身相互作用，導致DNA構象發生改變。不管GO是與DNA模板結合還是與DNA聚合酶結合，都會使PCR擴增效率降低，一定程度上抑制PCR，導致DNA產生非特異性擴增反應，使產物條帶變得不再單一，或是產生引物二聚體。

將測序得到的45 條適配體序列與原始序列相比，一部分序列的長度大于原始序列長度，可能是由于多次重復PCR造成的。這些序列長度的增加，有可能改變G-C對數量或莖距距離。這些有可能會改變適配體結構的穩定性或親和力。Sekhon等[44]研究了通過突變或刪除G-C對和干莖距離對銅親和力的影響。結果顯示，當G-C對從1增加2時，突變之后的適配體比原始適配體親和力增加了10 倍。若從原始適配體序列中刪除一個G-C對時，適配體結構改變，其親和力增加了100 倍。此外，莖間距也對親和力有影響，當間距從2 nt增加到4 nt時，改變后的適配體親和力有所下降，Kd值下降了近10 倍，由 7.88×10-11mol/L變為7.65×10-10mol/L。

基于核酸適配體的識別與檢測方法逐漸為一種新的普遍適用的技術，因此篩選AFB1的特異性適配體并發展核酸適配體技術應用于AFB1的檢測具有重要意義。本實驗所建立的基于核酸適配體識別的AFB1比色檢測方法，具有快速靈敏低成本易操作可視化等優勢，并可用于實際樣品的檢測，但AFB1與其適配體的結合機理還有待進一步研究。