免疫親和柱全自動凈化-超高效液相色譜-串聯質譜-全碳標記內標法精確測定糧油中玉米赤霉烯酮

吳 宇，葉 金,*，李 麗，李 森，軒志宏，崔 華，劉洪美，王松雪,*，馬海華，張 峰，何建洪

（1.國家糧食和物資儲備局科學研究院糧油質量安全研究所，北京 102629；2.河南工業大學信息科學與工程學院，河南 鄭州 450001；3.睿科儀器（廈門）有限公司，福建 廈門 361000）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是小麥和玉米等作物受到鐮刀菌污染后產生的一種真菌毒素[1]，具有類雌激素作用，影響動物的繁殖功能[2]，具有免疫毒性和遺傳毒性[3]，有潛在致癌性[4]。胡佳薇等[5]對陜西省10 個地市隨機采集市售谷物及其制品、玉米油等進行檢測，ZEN總檢出率為17.27%，玉米油的檢出率為79.37%，均值為149 μg/kg，谷物制品中有12 份樣品超標，超標率為1.64%。Piacentini等[6]對巴西76 份釀造用大麥中ZEN含量進行檢測，ZEN檢出率為73.5%，檢出值在 300～630 μg/kg。因此需要簡單、高效、精確的檢測方法對糧油中ZEN污染情況進行監測。

目前，食品中ZEN的檢測方法有薄層色譜法[7-9]、酶聯免疫吸附法[10-13]、氣相色譜質譜法[14-18]、高效液相色譜法[19-23]、液相色譜-質譜聯用法[24-31]。其中薄層色譜法由于精密度低、操作規程復雜耗時、分析結果重復性和再現性差，已經逐漸被其他儀器方法所取代。酶聯免疫吸附法方便、快捷、靈敏度高，可以作為快檢方法使用，但是容易產生假陽性。氣相色譜法適用于揮發性強、熱穩定性好的真菌毒素檢測，ZEN不易揮發，需要在進入氣相色譜柱前進行氮吹濃縮和衍生，步驟繁瑣，因此在真菌毒素檢測方面應用并不廣泛。高效液相色譜法是真菌毒素檢測中最常用的方法，特異性強、靈敏度高，但是容易受到干擾導致檢測假陽性。液相色譜-質譜聯用法可以提高分析的靈敏度和穩定性，具有分析速度快、抗干擾能力強等特點，能夠避免假陽性準確高效進行定性定量檢測，受到廣泛使用。

本研究將免疫親和柱凈化步驟自動化，用全碳標記穩定同位素內標法定量校正加標回收率及儀器基質效應，超高效液相色譜-串聯質譜法精確測定糧油中的ZEN。本方法無需氮吹、可批量自動化處理樣品36 個，實現無人值守，提高工作效率，同時避免因人員操作導致的結果偏差，提高方法精密度；內標法定量校正加標回收率及儀器基質效應，提高方法準確性。可用于實驗室能力比對及標物研制過程中的準確定值及均一性檢驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；磷酸鹽緩沖液鹽包、吐溫-20（色譜純） 美國Sigma公司；超純水 廣州Waston公司；ZEN免疫親和柱 中檢維康公司；同位素內標13C18-ZEN（25 μg/mL） Romer國際貿易（北京）有限公司；甲醇ZEN（20.52 μg/mL， 國家標準物質GBW(E)100301）、玉米全粉ZEN（國家標準物質GBW(E)100385）、全麥粉ZEN（質控樣品Wheat-ZEN-2018）、玉米油中ZEN（質控樣品Corn Oil-ZEN-2018）、大米粉ZEN和黃曲霉毒素（質控樣品RICE-ZEN&AFB1-2018）、糙米粉ZEN（質控樣品Brown rice-ZEN-2018）、玉米全粉空白（質控樣品Corn-Toxin-NK）、全麥粉空白（質控樣品Wheat-Toxin-NK）、大米粉空白（質控樣品Rice-Toxin-NK）、糙米粉空白（質控樣品Brown rice-Toxin-NK）、玉米油空白（質控樣品Corn oil-Toxin-NK） 國家糧食與物資儲備局科學研究院。

1.2 儀器與設備

Fotector Plus全自動固相萃取儀 睿科儀器有限公司；Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀 德國Thermo Fisher Scientific公司；3-30K離心機 美國Sigma公司；GT10-1高速臺式離心機 北京時代北利離心機有限公司；多管渦旋振蕩器 北京踏錦科技有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Cortecs C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），柱溫40 ℃；流動相A為甲醇，B為含體積分數0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸銨溶液，流速0.3 mL/min。 梯度洗脫條件：0 ～6 m i n，3 0%～5 0% A，7 0%～5 0% B；6 ～6.1 m i n，5 0%～9 5% A，50%～5% B；6.1～7 min，95% A，5% B；7～7.1 min，95%～30% A，5%～70% B；7.1～10 min，30% A，70% B。流速為0.2 mL/min，進樣量為2 μL。

1.3.2 質譜條件

加熱電噴霧離子源：溫度300 ℃；毛細管電壓3.2 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；鞘氣35 unit；輔助氣10 unit；Targeted-SIM模式；極性：正離子模式；掃描范圍m/z250～800；分辨率70 000；自動增益控制5×105；最大駐留時間20 ms；同時掃描的母離子數5；質荷比寬度m/z1.5。

1.3.3 樣品前處理

全自動固相萃取儀前處理法：準確稱取（5±0.01）g 樣品，加入20 mL 90%乙腈溶液，渦旋提取20 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液加入20 mL 0.1% PBST緩沖液，7 000 r/min離心5 min，取20 mL過濾液于全自動固相萃取儀的80 mL上樣管內，運行編好的方法對樣品進行自動凈化（具體步驟詳見表1，甲醇洗脫體積為2 mL），過膜上機檢測。

表1 全自動固相萃取儀免疫親和柱凈化程序Table 1 Purification programs of automatic solid phase extraction apparatus with immunoaffinity columns

1.3.4 樣品ZEN含量測定

準確移取ZEN標準儲備液適量，用甲醇逐級稀釋配制成不同質量濃度系列的標準工作液。分別吸取180 μL標準工作液，加入20 μL13C18-ZEN穩定同位素工作液于400 μL內插管中。將待測試樣品溶液和標準工作曲線進行檢測，得到ZEN及13C18-ZEN的峰面積，以標準溶液質量濃度為橫坐標，以相應的ZEN與13C18-ZEN峰面積比為縱坐標繪制標準曲線，由標準曲線得到試樣溶液中ZEN質量濃度。試樣中ZEN含量按下式計算：

式中：X為樣品中ZEN含量/（μg/kg）；ρ為樣品測定液中ZEN質量濃度/（ng/mL）；f為稀釋因子8；m為試樣的稱樣量/g。

2 結果與分析

2.1 上樣流速優化

實驗考察玉米基質加標稀釋液在上樣流速為2、4、6、8 mL/min時的柱回收率，結果如圖1所示，流速為2～8 mL/min時，回收率在95.2%～101.0%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在1.7%～3.8%之間。因此選擇8 mL/min的流速，即縮短上樣時間，又保證回收率最佳。

圖1 上樣流速對ZEN回收率的影響Fig. 1 Effect of sample loading flow rate on ZEN recovery

2.2 氣推次數的優化

淋洗之后，柱子內的殘留液體是否推得干凈是影響回收率的關鍵因素，因此優化淋洗之后的氣推次數保證柱子吹干至關重要，結果如圖2所示，以80 mL/min流速氣推3 次后柱子質量不再變化，說明柱子吹干。

圖2 氣推次數對柱子吹干情況的影響Fig. 2 Effect of number of pushing cycles on column mass

2.3 洗脫體積準確性考察結果

用全自動固相萃取儀考察1 mL甲醇洗脫免疫親和柱，接收洗脫液于10 mL離心管內扣緊蓋子用精密天平進行稱量，考察1 mL甲醇洗脫體積的準確性。結果表明1 mL甲醇洗脫體積平均值（n=6）為0.790 7 g，RSD值為1.7%，1 mL甲醇理論質量為0.79 g，因此可以用1 mL甲醇直接洗脫無需氮吹復溶。

2.4 方法線性、檢出限及定量限

表2 外標法和內標法定量方法的線性、檢出限和定量限比較Table 2 Comparison of linearity, LOD and LOQ between internal and external calibration methods

采用純甲醇配制ZEN內標和外標標準曲線，并按照樣品前處理方法對空白樣品進行處理獲得空白基質液，采用逐級稀釋法獲得ZEN的檢出限（RSN≥3）和定量限（RSN≥10）。如表2所示，本研究建立的內標法定量方法的線性相關系數為0.999 5，檢出限為0.33 μg/kg，定量限為1 μg/kg，RSD值為4.7%，均優于外標法定量方法。

2.5 日內精密度及回收率

分別采用本研究開發的內標方法與外標方法對配制的高、中、低3 個濃度梯度的玉米、小麥。大米、糙米、玉米油加標樣品進行檢測，結果見圖3。本研究開發的內標定量方法回收率在92.7%～101.3%之間，RSD值在0.02%～3.74%范圍內，外標法定量方法回收率在54.8%～76.4%之間，RSD值在0.5%～7.0%范圍內。超高效液相色譜-串聯質譜在離子化過程中容易受到基質干擾對目標化合物的響應有基質增加或者抑制效應。外標法由于沒有進行基質效應的校正使得基質中的ZEN響應明顯低于純溶液標準品中的響應導致回收率偏低。而全碳標記的13C穩定同位素內標由于和目標化合物有相同的保留時間和離子化效率，因此能夠有效校正基質效應，達到提高準確度和精密度的目的。因此內標法的回收率明顯優于外標法。

圖3 不同加標水平糧食樣品的回收率Fig. 3 Recoveries of ZEN from different grains at different spike levels

2.6 日間精密度

采用本研究開發的內標方法對3 個樣品連續4 d進行檢測，結果見表3。本研究開發的內標定量方法日間精密度（RSD）在0.7%～4.1%范圍內，重現性良好。

表3 新方法日間精密度Table 3 Inter-day precision of the new method

2.7 方法的準確性

表4 新方法對參考物質的測定結果（n=3）Table 4 Measured values for reference materials obtained by the new method (n= 3)

圖4 玉米樣品中ZEN（A）及13C18-ZEN（B）色譜圖及質譜圖（C）Fig. 4 Chromatograms and mass spectra of ZEN and 13C18-ZEN in corn samples

采用本研究開發的內標方法對質控樣品進行測定。如表4所示，所有測定值均在標示值范圍內。實際玉米樣品中的色譜和質譜圖見圖4，ZEN與13C18-ZEN的保留時間一致，但是精確相對分子質量又相差18.060 52，表明通過內標可以協助ZEN的定性判定。

3 結 論

本研究開發的免疫親和柱全自動凈化-超高效液相色譜-串聯質譜-全碳標記內標法精確測定糧油中的ZEN方法的檢出限為0.33 μg/kg，定量限為1 μg/kg，相關系數為0.999 5，回收率在92.7%～101.3%，RSD值在0.02%～3.74%，測定3 種基體質控樣品的結果均在標示值范圍內，準確性和精密度明顯優于外標定量方法。本實驗方法與其他方法[32-34]相比無需氮吹、可批量自動化處理樣品36 個，實現無人值守，提高工作效率，避免因人員操作導致的結果偏差，提高方法精確度；內標法定量校正加標回收率及儀器基質效應，提高方法準確性。可用于實驗室能力比對及標物研制過程中的準確定值及均一性檢驗。