離子色譜串聯三重四極桿質譜測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中的肌醇

王 巖，王 娟，吳春敏，張春林，王 東，高 鐲，張雷雷，張 巖

（河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

肌醇為環己六醇，分子式為C6H12O6，易溶于水，不溶于乙醚、氯仿等，具有類似維生素的作用，最早由動物肌肉組織中提取，自然界中存在9 種肌醇的立體異構體，其中最常見是肌-肌醇[1]。肌醇常被作為食品營養強化劑添加到保健食品、功能飲料和嬰幼兒配方食品中[2]，在嬰幼兒配方乳粉中屬于輔助添加性營養 物質[3]，根據G B 1 0 7 6 5—2 0 1 0《嬰幼兒配方食品》 在嬰幼兒配方食品中肌醇的添加量為1.0～9.5 mg/100 kJ，是人體必需的營養因子，在人體內以磷脂酰肌醇形式參與細胞膜的組成[4]，改善機體生長性能[5]，對嬰幼兒腦部和毛發發育有重要作用[6]，以及參與脂肪代謝[7]、抑制肝臟脂肪堆積[8]等功能。

目前，對于肌醇檢測常見的方法有酶法[9]、微生物法[10]、 氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-串聯質譜法[13-16]、離子色譜法[17]、液相色譜法[18]以及液相色譜-串聯質譜法[19-21]、 毛細管電泳法[22]等，GB 5009.270—2016《食品中肌醇的測定》中方法為微生物法[23]和氣相色譜法[24]，其中液相色譜法對復雜樣品分離度較低[25]，微生物法時間較長，高錳酸鉀氧化法損失較大，氣相色譜法中樣品通過前處理發生衍生[26]，再上機測定其衍生物含量，上述方法一般都存在前處理復雜[27-28]、回收效果不理想、測定周期長、檢出限和定量限偏高等問題。目前鮮見采用離子色譜串聯三重四極桿質譜法測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇的報道。

本實驗采用離子色譜串聯三重四極桿質譜法測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中的肌醇含量，通過優化實驗條件，建立適用于測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇含量的方法，該方法具有前處理過程簡單、回收率高、檢測時間短、檢出限和定量限低等優點，實現肌醇快速檢測，以期為檢測嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HCl（優級純） 國藥集團化學試劑有限公司；氨水、甲醇（色譜級） 德國Merck公司；IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱、0.45 μm濾膜（MCM） 博納艾杰爾科技公司；肌醇標準物質（99.5%，200 mg） 上海安譜實驗科技股份有限公司；乳粉標準參考物質QC-IP-707 中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心；乳粉標準參考物質（SRM）1849a 美國NIST公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

Dionex ICS-5000+離子色譜儀、Dionex ICS-5000+EG淋洗液自動發生器、Dionex ASRS 300電解再生抑制器、 Dionex AS-AP自動進樣器、TSQ Endura三重四極桿 質譜儀 美國Thermo Scientific公司；VORTEX 3渦旋混勻器 德國IKA公司；3K15離心機 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取嬰幼兒配方乳粉0.50 g（牛乳樣品1.00 g），于100 mL容量瓶中，添加15 mL超純水溶解提取，充分振蕩搖勻，用鹽酸調節pH值到4.0～6.0，用超純水定容至刻度，9 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液依次過0.45 μm濾膜、IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱，前2 mL濾液棄掉，進樣小瓶收集過濾液，待測。

1.3.2 色譜條件

考察Dionex IonPac AS16、Dionex IonPac AS19、Dionex IonPac AS20、Dionex CarboPac PA1和Dionex CarboPac MA1五種色譜柱對目標物肌醇分離性和選擇性的影響，并對不同濃度淋洗液進行選擇。淋洗液流速0.50 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積20～50 μL，ASRS 300陰離子抑制器（2 mm，外接水模式）。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源；負離子多反應監測模式；離子源溫度350 ℃；噴霧電壓2 500 V；碰撞氣流速0.15 mL/min；鞘氣流速40 mL/min；輔助氣流速10 mL/min；反吹氣流速0.4 mL/min。

1.3.4 基質效應

采用同一水平濃度下樣品基質溶液和標準品溶液中肌醇強度響應值的比值進行評估，對同一水平濃度樣品進行6 次重復測定。計算公式如下：

式中：α為基質效應/%；γ0為樣品本底響應值；γ1為標準品的響應值；γ2為樣品中添加標準品的響應值。

1.3.5 標準溶液的制備

精準稱取10 mg肌醇純品固體于100 mL容量瓶中，用超純水定容，得到100 mg/L肌醇標準儲備溶液；中間液為取1 mL肌醇標準儲備溶液于100 mL容量瓶中，用超純水定容，得到1 mg/L標準溶液；工作標準溶液是由中間液稀釋得到。

1.4 數據統計及圖表繪制

采用TSQ Endura 2.1 Tune和Xcalibur軟件進行數據統計和處理，采用Origin pro8軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

在電噴霧離子源負離子模式下，優化肌醇檢測的質譜條件，針泵連續進樣，Q1全掃模式掃描母離子，碰撞母離子為m/z179.112，通過選擇離子掃描模式，調整鞘氣、輔助氣和反吹氣流速，分別得到子離子為m/z87.183和m/z117.054，采用信號穩定、靈敏度高的子離子m/z87.183為定量離子，經過條件優化最終選擇的質譜條件如表1所示。

表1 肌醇質譜參數Table 1 Mass spectrometry parameters for inositol

2.2 離子色譜條件優化

2.2.1 色譜柱的選擇

選用Dionex IonPac AS16、Dionex IonPac AS19和Dionex IonPac AS20三種柱子時出峰不明顯，雜峰干擾多，選用Dionex CarboPac PA1色譜柱時基線不穩，保留時間長，響應值偏低，初期出現雜峰，而選用Dionex CarboPac MA1色譜柱保留時間短，10～11 min附近出峰，能夠實現快速分離檢測，分離度好，峰形較為對稱，基線低且平穩，出峰復現性好，因此，選擇Dionex CarboPac MA1色譜柱（2.0 mm×250 mm，7.5 μm）作為分析柱，Dionex CarboPac MA1型保護柱（2 mm×50 mm）。

2.2.2 淋洗液的優化

在離子色譜分析測試中常見的淋洗液為碳酸鹽溶液和氫氧根溶液，氫氧根溶液具有低背景和靈敏度較高的特點，氫氧根溶液通過抑制器會生成水相再進入質譜檢測，對質譜的污染小，提高質譜的穩定性，因此，淋洗液用KOH溶液。本實驗用KOH淋洗液自動發生器自動生成一定濃度的KOH溶液，避免了手工配制過程中空氣中CO2溶于淋洗液造成的基線漂移。

實驗采用梯度洗脫的方式，分別考察10、20、30、40、50 mmol/L濃度的KOH淋洗液對肌醇的分離洗脫效果。實驗發現，使用10 mmol/L和20 mmol/L低濃度的KOH淋洗液時，目標峰寬較大，拖尾嚴重，響應值相對偏低，而使用30、40 mmol/L和50 mmol/L的KOH淋洗液時，峰寬變窄，響應值也有所提高，能夠實現肌醇分離，但峰形對稱性不好，峰形較寬，有拖尾現象，影響積分定量，低濃度時易受基線干擾，而采用梯度洗脫，可以改善峰形，峰寬變窄，響應值也有相應的提高，因此，采用梯度洗脫的方式，梯度程序見表2。

表2 KOH溶液梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program with KOH solution

肌醇屬于弱極性化合物，在質譜中采用電噴霧電離時不易發生電離，出現響應值偏低、檢出限高、靈敏度低等問題，為改善這些問題，采用外加水模式在淋洗液中加入0.01%氨水-甲醇溶液，能夠明顯改善電離強度，提高檢測響應值和改善峰形。

2.3 樣品前處理的優化

嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇為游離態的肌醇，可直接用水溶解提取，振蕩搖勻，加酸使樣液中蛋白析出，離心取上清液過0.45 μm濾膜、IC-RP和IC-Ag固相萃取小柱，直接上機測定，樣品前處理過程簡單，避免待測目標物的損失和提高樣品處理效率，樣品前處理過程明顯優于現行國家標準中對乳粉測定采用的氣相色譜法。

2.4 基質效應

嬰幼兒配方乳粉及乳制品中含有復雜的組成成分，尤其含有大量的油脂和蛋白質等有機大分子物質，為盡可能降低樣品中的基質效應，本實驗通過樣品前處理優化，用鹽酸溶液調節樣液pH值，再將樣液過濾膜和固相萃取小柱起到凈化的作用，極大程度降低基質效應。

結果表明，肌醇的基質效應平均比值為95.3%，基質效應在可接受范圍內，樣品中的基質對肌醇的測定影響不大，能夠保證結果的穩定性和準確性，因此本實驗可忽略基質效應對測定結果的影響。

2.5 方法線性范圍與檢出限

用肌醇標準物質分別配制0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 μg/mL系列標準溶液，以肌醇定量離子對的峰面積為Y軸，系列標準溶液質量濃度為X軸進行線性回歸，回歸方程為Y=7 563.09＋315 926.4X，r＝0.999 8，線性良好。

稱取不含肌醇的嬰幼兒配方乳粉作為空白樣品，加入一定濃度的肌醇標準溶液，當信噪比為3時的樣品含量為檢出限，當信噪比為10時的樣品含量為定量限，因此，方法檢出限和定量限分別為0.023 mg/100 g和0.076 mg/100 g，檢出限和定量限均低于國家標準中固體或粉末樣品檢出限1.0 mg/100 g和定量限3.0 mg/100 g。

2.6 樣品回收率與精密度

用本方法測定乳粉標準參考物質樣品QC-IP-707（131.1 mg/100 g）和1849a（40.5 mg/100 g）（n=6）的回收率分別為99.1%和100.1%，如圖1所示。向標準參考物質樣品乳粉、嬰幼兒配方乳粉和牛乳中按本底50%、100%和200%不同水平添加肌醇標準溶液，混勻靜置1 h，按照1.3.1節前處理方法處理樣品，樣品回收率和精密度結果如表3所示。肌醇的加標回收率在90.3%～109.5%之間，相對標準偏差在0.7%～9.1%之間，滿足嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇含量的分析要求。

圖1 QC-IP-707（A）和1849a（B）中肌醇色譜圖Fig. 1 Chromatograms of inositol in QC-IP-707 (A) and 1849a (B)

表3 不同添加水平下乳粉和牛乳中肌醇的回收率和精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of inositol at different spiked levels in milk powder and milk samples (n = 6)

2.7 實際樣品的測定結果

市場隨機購買10 批次嬰幼兒配方乳粉和牛乳，采用該方法檢測其中肌醇含量，結果如表4、圖2所示。結果說明不同品牌的嬰幼兒配方乳粉之間肌醇含量存在一定差異。

表4 嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇含量Table 4 Inositol contents in infant formula and milk mg/100 g

圖2 嬰幼兒配方乳粉樣品（A）和牛乳（B）中肌醇色譜圖Fig. 2 Chromatograms of inositol in infant formula (A) and milk (B)

3 結 論

本實驗采用離子色譜串聯三重四極桿質譜法測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中的肌醇含量。通過優化樣品前處理方法、淋洗液成分、質譜參數，選擇合適的分離色譜柱和母離子與子離子的離子對，建立一種測定嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇含量的方法。該方法能夠獲得較好的分離效果、回歸線性和高靈敏度，檢出限和定量限均低于國家標準，且方法簡單快捷，能實現快速檢測，完全適用于嬰幼兒配方乳粉和牛乳中肌醇的測定。