黑白胡椒臘腸貯藏期中氣味活性物質演變及異味分析

周慧敏，趙 冰，吳倩蓉，李 素，潘曉倩，朱 寧，喬曉玲，王守偉，劉博文，張順亮

（中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術北京市重點實驗室，北京 100068）

臘腸屬于我國傳統腌臘肉制品，黑白胡椒是一種常用的調味品，一般黑胡椒的味道比白胡椒濃烈，白胡椒的味道更加柔和、清香，且香味比較穩定，不易散失；而白胡椒辛辣味更甚，所以驅寒效果更佳，調味效果稍差，常常配伍使用可達到風味和食療功效最佳的效果，因此黑白胡椒風味的臘腸廣泛受到消費者的喜愛。臘腸由于其水分活度低和防腐劑、色素、調味料、抗氧化劑的使用，一般擁有長達6～10 個月的貨架期。臘腸若貯藏不當會縮短貨架期，主要受氧化現象引起的感官惡化影響，因為致病菌或腐敗菌很難在臘腸中繁殖[1-3]。風味是評價其品質的重要指標之一，也是消費者購買時所參考的重要因素，還可預測產品的貨架期。研究認為，隨著貯藏時間的延長，腌臘肉制品的風味會逐漸發生變化，從而導致可接受性的喪失。在貯藏期中風味的劣變一般早于其他感官品質的變化[4-5]。酸敗和哈喇味是其風味惡化的主要原因，而其他可能形成的異味，如霉味、金屬味、腐臭味或辛辣味，是導致食用品質喪失的次要原因[6-7]。

風味惡化的原因較復雜，一方面是由于導致異味的風味化合物的形成或濃度增加，另一方面是由于腌制液、胡椒和其他香辛料、調味料等賦予的香味化合物的降解或逸失。通過監測揮發性風味物質的變化可以解析臘腸在貯存期間氣味的改變[8-10]。同時貯藏期間發生的理化反應（氨基酸的Strecker降解、美拉德反應、脂肪水解氧化等）也可以通過檢測揮發性風味物質指示。在眾多品種的臘腸中基本包括醛類、酮類、醇類、酯類、烷烴和萜烯等揮發性化合物[1]。根據其可能的來源分為香料（萜烯類和脂肪族硫化合物）、脂質氧化（醛類、烴類、醇類和酮類）、微生物酯化和料酒（如乙酸丙酯、丙酸乙酯和己酸乙酯）、碳水化合物發酵（如1,3-丁二醇和苯乙醛）、氨基酸分解代謝（如2-甲基丁醛、2-甲基-1-丁醇和2,3-丁二醇）、其他來源以及這些因素之間的交互反應[11-13]。而干腌腸貯藏中出現的酸敗與脂質氧化過程中醛、酮和羧酸的形成有關，在較小程度上與游離氨基酸，如賴氨酸、酪氨酸或天冬氨酸的產生有關。

國內針對臘腸的品質保持研究已有較多報道，如添加天然抗氧化劑、香辛料、調味料、發酵劑等及包裝、貯藏溫度的篩選[2,14-18]。且對不同類型臘腸中揮發性風味物質進行分析，如唐玲[19]檢測廣式臘腸中的揮發性風味物質主要為乙醇和短鏈乙酯類，占總揮發性物質的80%左右。宋永等[20]檢測哈爾濱風干腸中最主要的風味化合物為己酸乙酯，其次為乙醇、己醛和丁酸乙酯。張大革等[21]檢測傳統發酵干香腸中主要揮發性風味物質為酯類占42.07%、醛類占31.22%。不同種類的臘腸主體揮發性風味物質之間存在一定差異，并不是所有風味物質對產品整體風味有貢獻，氣味活性化合物的確定是食品風味研究的熱點和重點。另外目前針對風干腸、廣式香腸風味劣變的原因也有一些報道，研究認為脂肪過度氧化產生較多的醛、酮類物質，對臘腸風味造成負面 影響[12,18-19]；吳倩榮等[22]檢測風干腸中揮發性風味物質主要為酯類物質，經氣味活性值（odour activity value，OAV）分析以及氣相色譜-嗅聞（gas chromatographyolfactometry，GC-O）鑒定，辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛可能是造成風干腸異味的主要物質。但針對黑白胡椒臘腸在貯藏過程中氣味活性物質演變規律、異味解析及貨架期評價的相關研究鮮見報道。

本研究通過采用吹掃捕集-熱脫附-氣相色譜-嗅聞-質譜（purge & trap-thermal desorption-gas chromatographyolfactometry-mass spectrometry，P&T-TDS-GC-O-MS）聯用對不同貯藏時間的黑白胡椒臘腸樣品中的揮發性風味物質進行定性定量分析，結合OAV、感官評價和相關性分析，研究貯藏過程中黑白胡椒臘腸的氣味活性化合物的演變規律，以及解析異味的主要貢獻物質，并對其結果進行主成分分析（principal components analysis，PCA）和二維聚類熱圖分析，建立風味劣變和貨架期預測的有效評價手段，以期為臘腸風味保持和異味控制技術的開發提供支持，為優化其貯藏條件及提高風味品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬4號肉、豬背脂 北京中瑞食品有限公司；臘腸輔料 北京美添前景科技有限公司；2-甲基-3-庚酮標準品、C8～C20正構烷烴 美國Sigma公司；C10～C25正構烷烴 上海安普實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

0SCAR 20型灌腸機 德國海因里希弗雷機械制造有限公司；BYXX-50煙熏爐 中國艾博有限公司；Gerstel TDS-3半自動熱脫附進樣器、TC-200型多吸附管老化儀、Tenax-TA吸附管、嗅聞儀 德國Gerstel 公司；吹掃捕集制樣瓶 自制；TRACE1310-TSQ8000 GC-MS聯用儀、TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臘腸制作和取樣

產品配方：原料（4號肉∶背脂=4∶1）；配料（根據原料質量按比例添加）：亞硝酸鈉0.003%、鹽2%、白砂糖1%、葡萄糖0.5%、味精0.1%、白胡椒0.1%、黑胡椒0.15%、異抗壞血酸鈉0.15%、冰水10%。

工藝流程：分別將剔除筋膜的豬瘦肉和背脂切塊，通過8 mm孔板的絞肉機絞碎→按比例添加配料和原料攪拌→灌腸（膠原蛋白腸衣，23 mm）→打結（10 cm）→風干（45 ℃，48 h）→冷卻→包裝（常壓密封包裝）→后熟7 d（常溫）→成品→貯藏。

取樣：將黑白胡椒臘腸成品在37 ℃干燥箱中貯藏，分別在貯藏的第0、7、21、35、49、77天，共6 個點取樣。黑白胡椒臘腸在貯藏第77天的樣品顏色變黑，臘味香味喪失，異味非常強烈，完全不可接受，故貯藏至77 d后停止實驗；挑戰性貯藏（37 ℃有氧條件）是為了加速臘腸的氧化變質，以解析異味的主要風味化合物[22]。

1.3.2 P&T提取揮發性風味物質

在室溫條件下將臘腸用破壁機切碎混勻，準確稱取10 g樣品置于樣品瓶中，加入1 μL 2-甲基-3-庚酮標準品（0.816 μg/μL）作為內標物，旋緊瓶蓋，55 ℃平衡10 min；樣品瓶的一端通氮氣，吹掃流速為50 mL/min，另一端用已老化的TA吸附管富集臘腸的揮發性風味化合物，55 ℃吸附40 min后，取出吸附管用氮氣反吹10 min去除水分，之后在熱脫附進樣口進樣，每個樣品平行測定3 次取平均值[23]。

1.3.3 TDS-GC-MS測定揮發性風味物質程序[24]

T D S 程序：采用標準加熱模式，氦氣流速 20 mL/min，不分流；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持0.1 min；以40 ℃/min上升到210 ℃，保持5 min；傳輸線溫度215 ℃。

冷進樣條件：采用標準加熱模式；液氮冷卻；升溫程序：初始溫度-100 ℃，平衡0.1 min；以10 ℃/min升到215 ℃，保持5 min；分流比為30∶1。

GC條件：TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）提前凈化；高純氦氣（純度＞99.99%）為載氣；流速1.5 mL/min；不分流進樣模式，保持1 min。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min速率升溫至200 ℃，8 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持3 min。

MS條件：電子電離源，溫度280 ℃；傳輸線溫度230 ℃；電子能量70 eV；全掃描模式：質量掃描范圍 m/z 40～600。

1.3.4 嗅聞檢測[13,22]

揮發性風味混合物經GC分離后通過三通器分別進入質譜檢測器和嗅聞檢測器，分流比為1∶1，嗅聞傳輸線溫度為200 ℃。選取3 名嗅覺靈敏，并經過專業培訓的人員在嗅聞口進行嗅聞，記錄所聞到的氣味保留時間、氣味特征以及氣味強度。強度分為5 個等級（1=氣味非常微弱、2=氣味微弱、3=氣味中等、4=氣味強烈、5=氣味非常強烈）。每種風味化合物的氣味描述以及時間須由至少2 名評價員確認一致，則將該描述記為最終實驗結果。

1.3.5 揮發性風味物質分析

定性分析[22]：將色譜圖中的化合物與NIST、Wiley等數據庫進行比對，化合物的確定以正匹配和反匹配均大于700為準。并且利用系列正夠烷烴在相同升溫條件下的保留時間計算待測化合物的保留指數（retention index，RI），與文獻值[25]進行比對，結合嗅聞結果對貯藏期的臘腸中揮發性風味物質進行定性分析。

定量分析：根據化合物峰面積與含量的比值為定值，計算每一種風味化合物相對于內標物的含量，按式（1）計算未知揮發性化合物含量：

其中：CX為未知揮發性化合物含量/（μg/kg）；AX為未知揮發性化合物的峰面積/（AU·min）；C0為內標的質量濃度/（μg/μL）；A0為內標的峰面積/（AU·min）；V為內標的加樣量/μL；m為樣品的質量/g。

1.3.6 OAV的計算

采用OAV評價各化合物對樣品總體風味的貢獻[26]；風味閾值通過查閱文獻[27]，按式（2）計算OAV：式中：C為揮發性化合物含量/（μg/kg）；T為該物質在水中的察覺閾值/（μg/kg）。

1.3.7 感官分析

對不同貯藏時間點的黑白胡椒臘腸進行定量描述感官評價，參照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規范》[28]的要求，制定感官評價標準，選取10 名經過專業培訓的感官評價員，將臘腸切成2 mm左右厚的薄片，感官評價實行10 分制原則，總分為30 分，評分標準 如表1所示。

表1 感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Chinese sausage

1.4 數據處理

采用Excel對平均值、標準差、RI等數值進行計算以及繪圖；利用SPSS 21.0對原始數據進行Duncan單因素顯著性差異分析以及Pearson相關性分析。采用UnscrambX 10.1軟件對不同貯藏時間臘腸樣品組中風味活性化合物（OAV≥1）進行PCA。再利用Heatmapper網絡在線軟件對不同貯藏時間臘腸樣品組和風味活性化合物（OAV≥1）基于歐氏距離采用平均連接法同時進行二維聚類分析，并繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 貯藏時間對黑白胡椒臘腸感官評價的影響

表2 不同貯藏時間黑白胡椒臘腸感官評分Table 2 Sensory evaluation results of Chinese sausages added with black and white pepper at different times of storage

由表2可知，樣品的色澤和整體接受度得分在貯藏前7 d無顯著變化，之后隨著貯藏時間的延長均顯著下降（P＜0.05）。 臘腸的色澤逐漸從亮紅色（成品和貯藏7 d） 到暗紅色（貯藏21 d），褐色（35～49 d），最終為黑色（77 d），這是由于貯藏過程中亞硝基肌紅蛋白逐漸被氧化造成的，這與吳倩蓉等[22]的實驗結果相似。臘腸的風味得分在貯藏的前7 d略有增加，之后逐漸降低。這可能是由于貯藏前期脂肪水解氧化、氨基酸降解和微生物代謝等繼續產生臘腸的特征化合物，因此在貯藏第7天臘味更加濃郁。而之后臘香味和胡椒味逐漸減弱（21 d），略有異味（35 d），最終異味強烈和酸敗味明顯（49～77 d）。風味劣變，產生異味、哈敗味，可能來源于脂肪氧化變質、氨基酸過度降解，因為低濃度時具有正向風味貢獻的化合物在高濃度時可能變成異味。臘腸整體接受度得分與色澤、風味相一致，在貯藏的前7 d樣品有較高評分，其色澤、風味均處于最佳狀態，隨著貯藏時間的延長緩慢降低，而在貯藏第35天時色澤變褐，出現異味，為品質劣變的臨界點，表明到達貨架期的終點，之后產品劣變程度加速，變得不可接受。

2.2 黑白胡椒臘腸在貯藏過程中風味活性物質的演變規律

采用P&T-TDS-GC-MS聯合技術和RI比對檢測不同貯藏時間的黑白胡椒臘腸中揮發性風味物質，共鑒定出106 種揮發性風味物質，但其對產品總體風味特征的貢獻度是由風味體系中揮發性物質的濃度與感覺閾值共同決定的。一般認為，OAV≥1的揮發性風味物質為樣品的風味活性化合物，對整體風味有直接影響，且OAV越大該化合物對整體氣味的貢獻就越大。 0.1≤OAV＜1的組分被認為對樣品的總體風味具有重要的修飾作用[26,28]。因此進一步計算全部揮發性風味物質的OAV，得到56 種OAV≥0.1的化合物，如表3所示，醛類（15 種）最多，其次為烯烴類（9 種）、酯類（8 種）、酮類（7 種）、醇類（6 種）、其他雜環類物質（6 種）和酸類（5 種）。在不同貯藏時間6 組樣品中檢出OAV≥0.1的風味物質分別為37、39、38、39、40、40 種，說明貯藏前期揮發性化合物（OAV≥0.1）種類持續增加，中期保持穩定。由圖1可知，OAV總和分別為2 008.93、2 507.20、2 982.08、3 958.29、4 675.89、5 474.35。隨著貯藏時間的延長，風味物質的OAV總和逐漸增加，與成品比較（貯藏0 d），前21 d貯藏期的樣品總OAV增加不顯著，但在貯藏第35天時，總OAV增加顯著。其中醛類物質OAV占比最高，占85.85%～90.35%。除酯類和烯烴類物質，各類風味物質的OAV隨著貯藏時間的延長，均持續增加，與成品比較，尤其在貯藏35～49 d之間增加最顯著。而酯類的OAV在貯藏第14天出現了最低點，在其他貯藏時間點OAV持續增加。烯烴類在整個貯藏過程中OAV基本穩定。

表3 黑白胡椒臘腸在貯藏過程中氣味活性化合物的OAVTable 3 OAVs of various odor-active compounds in Chinese sausages added with black and white pepper during storage

續表3

圖1 各類氣味活性物質不同貯藏時間的OAV（A）和 OAV在不同貯藏時間的占比（B）Fig. 1 Actual (A) and percent (B) OAVs of various classes of odoractive compounds at different storage time points

2.2.1 風味活性醛類物質

由表3可知，黑白胡椒臘腸成品中風味活性醛類物質的OAV最高，達1 724.58，對成品整體風味貢獻率高達85.85%，其中主要是源于脂肪氧化的直鏈醛類，占98.76%，被認為是影響樣品整體風味的主要貢獻物。直鏈醛包括直鏈飽和醛（戊醛、己醛、庚醛等）、2-直鏈烯醛（順-2-庚烯醛）和2,4-直鏈二烯醛（2,4-壬二烯醛醛）。如圖2所示，直鏈飽和醛和2-直鏈烯醛在貯藏過程中持續增加，在貯藏末期（77 d）時其OAV分別是成品的4.75 倍和3.57 倍，而2,4-直鏈二烯醛的OAV在貯藏的前35 d持續增加近1 倍，之后趨于平緩，這主要由 反,反-2,4-癸二烯醛所主導，在肉制品中賦予油炸味。根據OAV的大小，醛類物質中對成品風味貢獻度最大的為反,反-2,4-癸二烯醛（1 005.25），其次是己醛（388.07）、庚醛（110.15）、反,反-2,4-壬二烯醛（65.02）、反-2-辛烯醛（63.99）、壬醛（48.73）等。

直鏈飽和醛，如戊醛具有辛辣味，己醛具有青草味，庚醛具有脂肪味，壬醛和辛醛具有油脂氣味、清新味。這些飽和醛在貯藏過程中顯著增加，在貯藏第77天樣品OAV是成品的3～7 倍。反-2-辛烯醛和反-2-癸烯醛賦予樣品堅果味、牛油味，這2 種對風味貢獻較大的2-直鏈烯醛在貯藏過程中也顯著增加，在貯藏第77天OAV是成品的3～4 倍。這些醛類物質濃度較小時，具備清香、脂肪的氣味，對成品的香氣起積極的作用；濃度較大時，則會變成異味。文獻[29-31,11-12]研究報道，庚醛、辛醛、壬醛來源于油酸的自動氧化；己醛、反-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛是亞油酸自動氧化的主要產物，戊醛是13-亞油酸過氧化氫的熱解產物；其他醛類如反-2-辛醛、反-2-癸烯醛和反,反-2,4-壬二烯醛也來源于其他脂類的氧化。說明脂肪氧化反應對產品的異味具有很大的貢獻作用。

其他少量的非脂肪族醛類，如2-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基苯甲醛，源于支鏈氨基酸和苯丙氨酸的Strecker降解或微生物代謝[11]，主要貢獻巧克力、杏仁和焦糖味。除4-乙基苯甲醛，其他的氨基酸代謝醛類均在成品中檢到，且隨著貯藏期的延長呈現增加的趨勢，尤其是2-甲基丁醛和苯乙醛在貯藏后期（35 d后）增加顯著，OAV達到50左右。說明在貯藏過程中氨基酸代謝反應對產品后期異味的生成有一定貢獻。

圖2 各類直鏈醛類OAV在不同貯藏時間的變化Fig. 2 Changes in OAVs of various straight-chain aldehydes at different storage time points

2.2.2 風味活性醇類物質

黑白胡椒臘腸成品中醇類物質的OAV占比次高，為169.72，對成品整體風味貢獻率為8.45%，樣品在貯藏過程中分別檢出4、3、5、5、5、3 種風味活性醇類化合物，除了芳樟醇，其他大部分均為源于脂肪氧化的正構醇。其中對風味貢獻較大的為芳樟醇（154.97）和1-辛烯-3-醇（13.04）。具有薰衣草香的芳樟醇經常在黑白胡椒的揮發性氣味中被發現[32]，在貯藏過程中增加不顯著（P＞0.05）。而具有蘑菇氣味的1-辛烯-3-醇被普遍認為是花生四烯酸中12-過氧化氫的氧化產物[29]，在貯藏過程中顯著增加（P＜0.05），貯藏的第77天OAV為111.55，增幅達到7.5 倍，是異味產生的主要因子。這與其他 研究[22,33]結果相似，但在半發酵香腸中未檢到[34-35]。

2.2.3 風味活性酯類物質

雖然黑白胡椒風干腸成品中酯類物質含量較低，但由于其風味閾值較低，因此對成品整體風味有一定貢獻，為3.58%。樣品在貯藏過程中分別檢出5、6、6、6、5、7 種風味活性酯類化合物，多為C2～C10羧酸乙酯類和內酯類。一方面可能源自脂肪氧化產生的羧酸與醇，或與微生物代謝產生的小分子酸、醇發生酯化反應，另一方面脂肪水解產生的游離脂肪酸可能發生酯化反應或是羥基脂肪酸水解后生成羥基酸，經過加熱脫水、環化生成內酯，酯類物質賦予風干腸水果香氣[25]。隨著貯藏時間的延長，酯類物質OAV呈現先減少，21 d后呈現增加的趨勢，這主要由OAV最高的異戊酸乙酯主導。在加工后期酯類物質的增加可以掩蓋異味。酯類物質在貯藏過程中的變化趨勢與其他研究者[22]的研究結果相似，但酯類物質對產品的貢獻度差別很大，這主要由于產品制作配料的差異。Lorenzo等[35]在半干發酵香腸中檢測到的酯類物質為甲酯類，且隨著貯藏時間的延長而逐漸減少。

2.2.4 風味活性酮類和酸類物質

酮類和酸類對成品整體風味貢獻率分別為0.63%和0.30%，在貯藏過程中顯著增加2～4 倍（P＜0.05）。不同樣品組中，分別檢測到酮類物質3、4、4、5、4、4 種，主要是2-庚酮、3-羥基-2-丁酮，在大部分腌臘制品中均為特征性風味化合物。酮類化合物可能是由多不飽和脂肪酸的熱氧化或降解產生的[29,33]。烯酮有一種甜味和水果味，如甲基庚烯酮在貯藏中后期未檢出。而二酮通常有肉和奶油味[29,36]，如2,3-戊二酮在貯藏后期檢測到。 3-羥基-2-丁酮存在于烤煙葉、奶油、可可、水果中，有令人愉快的奶油香味，僅在成品中檢到。值得注意的是，貯藏過程中顯著增加的是甲基酮、2-庚酮和2-壬酮，具有肥皂、干酪味，可能是異味的貢獻者。有研究報道，不飽和脂肪酸，亞麻酸、亞油酸、花生四烯酸氧化生成己醛、戊醛、辛醛、壬醛等直鏈醛，還有甲基酮[32]。

中鏈偶數脂肪酸被認為是奶酪風味的直接因素，因為它們的感知閾值很低。長鏈游離脂肪酸（大于12的碳原子）對風味的貢獻很小[37]。風干腸成品中OAV大于0.1的酸類物質包括丁酸、戊酸、己酸、癸酸等，來源于脂質降解或氧化。每種短鏈脂肪酸都有獨特的風味。例如，丁酸有腐臭和奶酪味，而己酸有辛辣味，戊酸有腐臭味[25]。 在貯藏過程中這些酸類OAV顯著增加，其中，己酸和戊酸在貯藏第77天后分別增了3.20 倍和5.53 倍。另外，支鏈酸類，3-甲基丁酸有酸味和汗臭味，且在貯藏末期OAV顯著提高，這些酸類可能也是異味的貢獻者。

2.2.5 風味活性烯烴類物質和雜環類化合物

烯烴類對成品整體風味貢獻率為0.5%，隨著貯藏時間延長，貢獻率逐漸降低。烯烴類物質主要為d-檸檬烯和石竹烯，d-檸檬烯具有柑橘、薄荷味，石竹烯具有木香味。烯烴類來源于產品制備時加入的黑白胡椒[38-39]。不同樣品組中還檢測出一些OAV大于0.1含氮含氧雜環類物質，如茴香腦、2-丁基呋喃、2-戊基呋喃、均三甲苯、鄰-異丙基苯和2,3,5-三甲基吡嗪。其中成品中茴香腦和鄰-異丙基苯OAV較高，這可能來源于制作過程中所添加的香辛料，在整個貯藏過程中基本無變化。2-戊基呋喃存在大多數腌臘肉制品中，是亞油酸二次氧化的產物[29]，具有綠豆和黃油的氣味，在貯藏前21 d中增加不顯著，之后顯著增加，增量約是成品的50 倍。另外2-丁基呋喃僅在貯藏末期檢測到，因此這2 種呋喃類被認為是異味的因子。2,3,5-三甲基吡嗪是黑白胡椒臘腸中唯一的含氮雜環化合物，是美拉德反應產物，具有奶油香味，在貯藏前期OAV為0.1～0.2，貯藏末期未檢測到，說明貯藏后期美拉德反應降低，這可能由于貯藏后期產品水分活度降低抑制了反應的進行。

2.3 貯藏時間、風味感官評分與風味活性物質之間的相關性

表4 貯藏時間、風味感官評分與風味活性物質的Pearson相關系數Table 4 Pearson’s correlation coefficients of odor active compounds with storage time and sensory flavor score

表4僅列出了與貯藏時間、風味感官評分顯著相關（P＜0.05）的氣味活性物質，表3中56 種風味有17 種化合物，如醛類（2-甲基丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛）、醇類（1-辛烯-3-醇、芳樟醇）、酮類（2-庚酮）、酸類（戊酸、己酸、3-甲基丁酸）、酯類（異戊酸乙酯、癸酸乙酯）和2-戊基呋喃，這些風味物質的OAV與貯藏時間呈顯著正相關（R=0.828～0.988），并與風味感官評分呈顯著負相關（R=-0.979～-0.844），同時貯藏時間與風味評分也顯著負相關。這表明隨著貯藏時間的延長，這些風味物質的濃度也增加，同時風味也逐漸惡化，因此這17 種化合物是貯藏時間和風味惡化的最佳預測指標。

2.4 黑白胡椒臘腸主體特征風味和異味解析

表5 GC-O法鑒定不同貯藏時間黑白胡椒臘腸中的香氣特征Table 5 Aroma characteristics identified by GC-O of Chinese sausages added with black and white pepper at different storage time points

GC-O技術是將GC分離化合物的能力與人的嗅覺相結合，以更好地鑒定氣味活性物質及其對總體風味的貢獻。由表5可知，反,反-2,4-癸二烯醛、己醛、芳樟醇、庚醛、反,反-2,4-壬二烯醛、反-2-辛烯醛和異戊酸乙酯的氣味強度較大，對黑白胡椒臘腸成品貢獻脂肪味、油炸味、青草味、果香、花香、奶油味等香氣特征，因此這些化合物是臘腸成品的主體特征風味物質，這與OAV結果基本一致。這些化合物來源于脂肪氧化、胡椒和酯化反應，表明一定程度的油脂氧化構成黑白胡椒臘腸香味的基本特征。

食物風味劣變可能是由于對食物產生負面影響的揮發性成分的濃度增加產生的，也可能是由于香味物質的損失，或者是這2 種影響的綜合結果。在本研究中，除了具有薯條味的未知物和宜人的花香、檸檬味的胡椒源化合物（芳樟醇、石竹烯、茴香腦、d-檸檬烯、月桂烯、β-蒎烯等）氣味強度降低或保持恒定外，脂肪氧化源氣味在貯藏的樣品中均有所增加。在貯藏末期氣味最強烈的化合物是己醛、反,反-2,4-癸二烯醛、庚醛、辛醛、反-2-辛烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和反-2-癸烯醛，在產品中具有深度油炸味和酸敗味。結合OAV分析、感官評價及相關性分析結果可知，這8 種化合物的OAV均隨著貯藏時間的延長而增大，嗅聞到該化合物氣味強度增強，產品的風味逐漸惡化，與風味感官評分顯著負相關，因此推測這8 種化合物在貯藏過程中氣味的強度大量增加打破了產品微妙的風味平衡，是黑白胡椒臘腸貯藏過程中風味劣變的主要原因。

2.5 基于OAV大于1風味活性化合物的PCA和聚類分析

PCA法是一種通過降維技術將多個變量轉化為少數幾個PC的實用統計分析方法，能夠最大程度地反映原始變量所包含的信息，簡化原來的多維問題。

基于篩選出的主體風味成分，采用PCA法對不同貯藏時間點的臘腸進行分析，得到不同貯藏時間臘腸中主體風味成分的得分圖（圖3A）與相關性載荷圖 （圖3B）。由圖3A可知，PC1貢獻率為86%，PC2貢獻率為12%，累計貢獻率達到98%，表明PC1、PC2能夠較好地反映樣品特征。除貯藏49 d和77 d的樣品在第1象限有重疊，其他貯藏點的4 組樣品均沒有重疊。與感官評價結果基本相同，說明基于風味活性化合物PCA分析能夠將不同貯藏時間的臘腸樣品判別出來。不同樣品在圖3A中的分布呈現明顯的變化趨勢，隨著貯藏時間的延長，樣品分布依次從第3象限移動到第2象限，再移動到第1象限，最后移動到第4象限，且樣品PC1的得分從負方向依次移動到正方向。貯藏35 d前的樣品分布在PC1負方向，而貯藏35 d后的樣品分布在PC1正方向，因此貯藏35 d為樣品風味惡化的分界，與感官評價結果一致。

變量的載荷系數反映了臘腸中揮發性風味成分對各主成分的影響程度，載荷系數絕對值越大，表明該變量對主成分的貢獻也越大。一般來說，分布于得分圖特定部分的樣本具有載荷圖中相同位置變量的許多屬性。由圖3B可知，沿著PC1，可以觀察到僅有5 種風味物質（十二醇、3-羥基-2-丁酮、4-甲基-2-己酮、1-石竹烯和β-蒎烯）的載荷系數為負數。這也表明位于評分圖左側的臘腸成品及貯藏早期的樣品中這5 種風味物質有更高的濃度。其他32 種風味物質在橫軸上的載荷系數均為正數，其中己醛載荷系數最大，其次是庚醛、辛醛、 1-辛烯-3-醇、2-庚酮、戊酸、己酸、癸酸乙酯、反-2-辛烯醛、2-甲基丁醛。它們彼此接近，即高度正相關，遠離中心，大多為脂肪氧化源風味物質。這也意味著位于評分圖右側的樣本，即貯藏后期的樣品中這幾個變量有更高的值。PC2中反,反-2,4-癸二烯醛的載荷系數最高，在PC2的風味信息中起主要作用，可解釋風味物質方差信息量的12.00%；各成分中的代表性風味物質在評價臘腸的貨架期中有重要的作用。

圖3 PCA得分圖（A）和相關載荷圖（B）Fig. 3 PCA score plot (A) and correlation loadings plot (B)

聚類分析可以直觀地對樣品進行歸類，同時熱圖將結果以一種漸進的色帶直觀地展現出來，可以看出樣品中風味物質含量的高低程度和變化的趨勢[40]。由圖4可知，成品和貯藏35 d前的樣品被聚為第1組，而貯藏49 d和貯藏77 d的樣品被聚為第2組。圖4色帶表明：除了16（十二醇）、17（4-甲基-2-己酮）和 19（3-羥基-2-丁酮），其余大多數的風味物質在第1組（貯藏初期的樣品）中呈現藍色和白色，在第2組（貯藏后期的樣品）中大多數的風味物質呈現黃色，即含量隨著貯藏時間的延長而增加。對于風味物質，3（己醛）和12 （反,反-2,4-癸二烯醛）聚為一類，其他34 種風味物質聚為1 類。因此二維聚類熱圖分析結果與PCA結果基本一致。

圖4 二維聚類熱圖Fig. 4 Heatmap of two-dimensional cluster analysis

3 結 論

采用P&T-TDS-GC-O-MS聯用技術結合OAV計算對不同貯藏時間的黑白胡椒臘腸中風味活性化合物進行分析，得到56 種OAV不小于0.1的化合物，其中醛類物質種類（15 種）和OAV占比均最高，對整體風味貢獻率高達85.85%～90.35%，主要是源于脂肪氧化的直鏈醛類；其次為醇類、酯類、酮類、酸類、烯烴類以及其他雜環類物質，共同構成黑白胡椒臘腸的風味。感官評價結果表明隨著貯藏時間的延長，黑白胡椒臘腸的顏色逐漸變暗，臘味和胡椒味逐漸降低，貯藏后期異味明顯加重，可接受度降低。結合相關性分析確定出17 種風味活性物質的OAV與貯藏時間呈顯著正相關，并與風味感官評分呈顯著負相關，可作為貯藏時間和風味惡化的最佳預測指標。經GC-O鑒定在貯藏末期氣味最強烈的化合物是己醛、反,反-2,4-癸二烯醛、庚醛、辛醛、反-2-辛烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和反-2-癸烯醛，且它們的OAV大于60，在貯藏過程中氣味強度增加，在產品中具有深度油炸味和酸敗味，可能是貯藏過程中臘腸氧化變質后產生異味的主要物質。基于OAV大于1風味活性成分，PCA和聚類分析可以作為一種客觀的判定和分離不同貯藏時間的黑白胡椒臘腸樣品的多元統計分析方法。