熱處理條件對巴氏殺菌乳風味品質的影響

楊姍姍，丁瑞雪，史海粟，洛 雪，楊 梅，岳喜慶，武俊瑞

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

巴氏殺菌乳因其殺菌條件溫和、較好保留了原料乳中的營養物質和風味，受到消費者的廣泛喜愛[1-2]。與超高溫瞬時殺菌乳相比，巴氏殺菌乳熱處理溫度低，蛋白質變性程度較小，脂肪氧化程度低，不易產生蒸煮味、脂肪氧化味、焦糊味等不良風味，較好的保留了原料乳中的風味[3]。

對于乳品的風味測定，傳統方法主要采用溶劑萃取、蒸餾萃取和感官鑒定等方法，然而這些方法存在耗時、結果不精確等缺點。隨著風味檢測技術的不斷發展，電子舌、電子鼻、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等高新檢測技術越來越多地應用于乳品風味檢測中[4-6]。相關研究表明，不同熱處理條件下的牛乳揮發性風味物質在含量及組成等方面具有明顯差異[7-8]。巴氏殺菌乳中的揮發性風味物質主要有酮、酯、醛、酸等，在加工過程中，其含量處于動態變化，對巴氏殺菌乳風味的形成起著重要作用[9]。電子舌作為一種新興的智能感官儀器，目前已經廣泛地應用于乳品行業，如摻偽檢測、新鮮度評定以及不同來源牛乳樣品的區分等[10-11]。頂空固相微萃取-GC-MS聯用技術因操作簡便、靈敏度高被廣泛應用于食品揮發性風味物質檢測中[12-14]。研究表明，游離氨基酸含量與熱處理有關，而一些氨基酸具有呈味特性，因此測定乳中呈味氨基酸的含量對風味品質影響尤為重要[15]。全自動氨基酸儀能夠較為準確地測定乳品中的游離氨基酸含量，具有準確性高、操作簡便、儀器穩定等優點[16-17]。

本實驗采用電子舌、GC-MS以及全自動氨基酸分析儀對不同熱處理條件下的巴氏殺菌乳風味品質進行對比分析，以期為巴氏殺菌乳的生產加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳樣品采自沈陽輝山乳業有限公司，置于醫用冷藏箱中，于2 h內運回實驗室并在4 ℃保存。

2-甲基-3-庚酮（分析純） 上海阿拉丁化學試劑有限公司；5-磺基水楊酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DW-86L338(J)超低溫冰箱、TGL-168高速臺式離心機 德國Eppendorf公司；InsentSA402B電子舌 日本Insent 公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB固相微萃取纖維 美國 Supelco公司；7890A-5975C GC-MS聯用儀 美國Agilent公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將采集的鮮牛乳樣品參照目前我國乳品工業中常用的熱處理方法以及借鑒美國食品藥品管理局相關標準，制定巴氏殺菌乳熱處理工藝的方法，流程如下：采集生鮮牛乳→預熱→巴氏殺菌。

巴氏殺菌條件分為2 組：1）低溫長時間殺菌：利用水浴鍋進行，在62、65、68 ℃分別殺菌20、25、30 min和35 min；2）高溫短時間殺菌：采用輝山乳業的中試型巴氏殺菌設備，在72、75、80、83 ℃和85 ℃分別殺菌15、20 、30 s，所有技術規范按照中國奶業標準進行。樣品處理結束后，分裝冷凍于-80 ℃冰箱中待測。

1.3.2 電子舌味感的測定

取適量體積的巴氏殺菌乳置于電子舌測定專用的小杯中，利用電化學傳感器原理測定巴氏殺菌乳樣品的綜合味覺信息，從而對被測試樣進行定量和定性分析。本次實驗測定酸、甜、苦、澀、咸、鮮6 種味感的豐富度。

1.3.3 揮發性風味成分的測定

根據張曉梅等[18]的研究方法稍作修正。取10 g牛乳樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，加入0.5 g NaCl、10 μL 2-甲基-3-庚酮（1 μg/mL）標準品，用鋁蓋封口，鋁蓋內由進樣針針頭可刺穿的聚四氟乙烯和硅膠墊密封。將樣品瓶置于50 ℃水浴鍋中加熱并快速攪拌，平衡5 min后，在50 ℃條件下吸附40 min后將吸附層收回到針頭并移出樣品瓶，利用GC-MS儀進行揮發性風味物質的測定，GC-MS條件設置借鑒Vazquez-Landaverde等[19]的方法。

G C 條件：色譜柱為D B-5 非極性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱流速1 mL/min，載氣為高純氦氣，檢測器溫度250 ℃，進樣器溫度250 ℃，不分流進樣；程序升溫：35 ℃保持1 min，以10 ℃/min升到110 ℃，以0.5 ℃/min升到115 ℃，再以6 ℃/min升到160 ℃，最后以10 ℃/min升到200 ℃，保持8 min。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，質量掃描范圍40～350 u。

1.3.4 游離氨基酸含量的測定

根據吳尚儀等[20]的方法稍作改進，分別取各巴氏殺菌乳樣品2 mL，以轉速15 000 r/min離心15 min，取上清液并加入2 mL 5%磺基水楊酸溶液以1∶1比例混合均勻，再次將混合液以轉速15 000 r/min離心20 min，吸取上清液800 μL過0.22 μm的水系濾頭，注入2 mL的氨基酸進樣瓶中，備用、待測。

利用L-8900型全自動氨基酸分析儀進行氨基酸含量的測定，儀器柱溫57.0 ℃，反應柱溫135 ℃，泵1流速為0.45 mL/min，泵2流速為0.35 mL/min，進樣量20 μL。紫外檢測器：脯氨酸在波長440 nm處測定吸光度，其他氨基酸在波長570 nm處測定吸光度。氨基酸含量通過與標準品中氨基酸積分含量作為參考，最終獲得各巴氏殺菌乳中16 種氨基酸的含量。

1.4 數據分析

1.4.1 電子舌

對不同熱處理條件下巴氏殺菌乳的酸、苦、澀、鮮、甜、咸、豐富性的味感值進行測定，每個樣品平行測定3 次，繪制雷達圖并進行味感值的相關性分析。

1.4.2 GC-MS

通過Excel 2010軟件對揮發性風味物質數據進行匯總處理，SPSS 22.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析。

1.4.3 游離氨基酸

通過Excel 2010軟件對游離氨基酸數據進行匯總處理，Origin 2018軟件繪制熱圖并進行分析。

2 結果與分析

2.1 電子舌評價分析

2.1.1 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳電子舌雷達圖分析

圖1 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳味感值雷達圖Fig. 1 Radar maps of taste values of pasteurized milk under different heat treatment conditions

如圖1所示，利用電子舌傳感器對不同熱處理條件下巴氏殺菌乳的酸、苦、澀、鮮、豐富性、咸、甜等味感值進行測定，其中豐富性味感值最大，酸的味感值最小，其他味感值介于兩者之間。低溫長時巴氏殺菌組（圖1A）與原料乳相比，在68 ℃殺菌35 min時澀的味感值變化較為明顯，造成此現象的原因可能是由于長時間殺菌導致巴氏殺菌乳中蛋白質分解，產生了一些小分子呈味肽[21]；而其他幾種味感值與原料乳相比，無明顯變化。高溫短時巴氏殺菌組（圖1B）與原料乳相比，各味感值均無明顯變化，說明高溫短時巴氏殺菌能較好地保留原料乳中的風味[22]。

2.1.2 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳味感值的相關性分析

表1 味感值的相關性分析Table 1 Correlation analysis among taste values

如表1所示，甜的味感值和酸、鮮呈顯著正相關；咸的味感值和酸呈極顯著負相關，與苦和鮮呈極顯著正相關；豐富性與酸呈極顯著負相關，與苦、鮮、咸呈極顯著正相關。由此可見，不同熱處理條件下巴氏殺菌乳味感值之間具有一定的相關性。

2.2 GC-MS測定結果

2.2.1 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳揮發性風味物質

如圖2所示，利用GC-MS技術檢測不同熱處理條件下巴氏殺菌乳中的風味物質，結果表明：原料乳中共有19 種揮發性風味物質，主要為醇、酯、烷、酸等物質；11 種加熱后消失，8 種受熱處理條件影響在含量上發生變化，共產生了42 種新物質。低溫長時巴氏殺菌組 （圖2A）中，烷類、醛類物質的含量無明顯變化；在同一溫度下，酯類物質的含量隨著熱處理時間的延長增加，但隨著溫度的上升，其含量減少。乳中酯類物質是通過脂肪酸與脂肪醇發生酯化反應形成的，通常酯類物質具有特殊的香氣，對乳的風味形成具有重要作用[23-24]。 酸類物質含量隨溫度變化較為明顯，隨著殺菌時間的延長，酸類物質含量升高，這可能是由于熱處理導致乳中脂肪的水解，產生了脂肪酸[25]。醇類物質種類無明顯變化，但含量有所提升。高溫短時巴氏殺菌組 （圖2B）中，酚、醛、酮三類物質變化較為明顯。醛類共有5 種，新產生了4 種醛類物質，在80 ℃和83 ℃時其含量增加。醛類物質也是乳中風味物質的主要成分，是乳中脂肪氧化反應的中間產物[26-27]。原料乳中沒有酮類，均通過加熱處理產生，但當溫度升高到83 ℃時，酮類物質基本消失。酮類物質是脂肪β氧化的產物，是乳風味物質的主要組成成分[28-29]。酚類物質在72 ℃時產生，溫度較低時不利于酚類物質產生。

圖2 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳揮發性風味物質種類數對比Fig. 2 Comparison of volatile flavor compounds in pasteurized milk under different heat treatment conditions

2.2.2 PCA結果

圖3 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳揮發性風味物質種類PCAFig. 3 PCA of volatile flavor compounds in pasteurized milk under different heat treatment conditions

由圖3可知，PC1貢獻率為79.82%，PC2貢獻率為8.9%，二者整體貢獻率超過80%，說明該PCA能夠反映出不同熱處理條件下巴氏殺菌乳揮發性風味物質的種類差異。兩樣本點間的距離越近，說明兩樣本的揮發性風味物質的種類組成越相似。從圖3可以看出，不同條件熱處理對巴氏殺菌乳的揮發性物質種類影響顯著，原料乳、低溫長時巴氏殺菌組和高溫短時巴氏殺菌組各自聚為一簇，2 個熱處理組別的主要揮發性風味物質也各不相同。低溫長時巴氏殺菌組中，醇、酯、酸、烷類物質較為豐富；而高溫短時巴氏殺菌組中，酚、醛、酮類物質較多。

2.2.3 聚類分析

圖4 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳揮發性風味物質種類聚類分析Fig. 4 Cluster analysis of volatile flavor compounds in pasteurized milk under different heat treatment conditions

由圖4可知，7 類風味物質被聚為3 類，第1類為酚、醛、酮，是高溫短時殺菌組產生的主要風味物質；第2類為酯、酸、醇，主要由低溫長時巴氏殺菌組產生；第3類為烷類物質，乳中的烷類物質可能來源于飼料，經過消化轉移到乳中[30]。該結果與圖3結果基本保持一致，較好反映不同熱處理條件下巴氏殺菌乳揮發性風味物質的差異性。

2.3 氨基酸測定結果

2.3.1 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳中游離氨基酸測定結果

圖5 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳游離氨基酸含量熱圖Fig. 5 Heat map of free amino acids in pasteurized milk under different heat treatment conditions

利用全自動氨基酸分析儀對不同熱處理條件下巴氏殺菌乳的游離氨基酸含量進行測定，并采用Origin 2018軟件對測定結果進行分析，并繪制非聚類熱圖。如圖5所示，紅色越深，表示游離氨基酸含量越高；藍色越深，表示游離氨基酸含量越低。不同熱處理條件下巴氏殺菌乳中的酪氨酸（Tyr）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、蛋氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）的含量很少，且含量幾乎不隨熱處理條件變化而變化；其他游離氨基酸含量較高，并且隨熱處理條件的改變，呈無規則變化，這一結果與宋慧敏[31]的研究結果一致。相關研究表明，乳中存在的耐熱酶在熱處理過程中會使蛋白質酶解，導致游離氨基酸的含量增加；并且在熱處理過程中，氨基酸自身也會發生裂解，或與乳中的糖類物質發生美拉德反應，導致游離氨基酸數量減少[32-34]，這可能是本研究巴氏殺菌乳中的游離氨基酸含量隨熱處理條件的改變，發生無規則變化的原因。

2.3.2 不同熱處理條件下巴氏殺菌乳中呈味氨基酸分析

表2 呈味氨基酸含量及所占比例Table 2 Contents of taste amino acids and their proportions relative to total amino acids

游離氨基酸的呈味特性與側鏈R基團的疏水性有關，當氨基酸的疏水性較小時，氨基酸呈甜味，如絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸等；當氨基酸的疏水性較大時，氨基酸呈苦味，如纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸等；當側鏈為酸性基團時，氨基酸呈鮮味或酸味，如谷氨酸和天冬氨酸[35-36]。將不同熱處理條件下巴氏殺菌乳中的游離氨基酸按呈味特性進行劃分，并對呈味氨基酸的質量分數及所占比例進行統計，如表2所示。

從表2可以看出，低溫長時殺菌組鮮味氨基酸占比隨殺菌溫度升高、殺菌時間延長大致呈上升趨勢，在68 ℃、30 min時達到最高值63.65%；高溫短時殺菌組鮮味氨基酸占比呈現規律波動趨勢，在75 ℃、30 s和83 ℃、20 s達到高峰，之后又下降。苦味氨基酸所占比例在低溫長時殺菌組無明顯變化；在高溫短時殺菌組，苦味氨基酸所占比例與原料乳相比有所提高，隨殺菌條件的改變，所占比例無規則波動。甜味氨基酸所占比例幾乎不隨殺菌條件改變，但在75 ℃、20 s時，甜味氨基酸所占比例突然增加，并達到最大值45.36%，其原因有待進一步研究。

3 結 論

不同熱處理條件下巴氏殺菌乳的味感值之間具有一定的相關性，高溫短時巴氏殺菌組與原料乳的味感值更接近，能較好地保留原料乳中的風味。原料乳中共有19 種揮發性風味物質檢出，而其中11 種熱處理后均消失，其余8 種物質的含量受熱處理條件的不同而發生變化。同時，牛乳經熱處理后共產生了42 種新物質。低溫長時巴氏殺菌有利于鮮味氨基酸的產生，高溫短時殺菌使乳中苦味氨基酸的含量提高。由此可見，不同的熱處理方式對巴氏殺菌乳的風味品質有不同的影響。在滿足殺菌和產品工藝要求情況下，隨著人民生活水平的不斷提高，對于巴氏殺菌乳風味品質的個性化要求會越來越多，因此本研究將為針對不同消費者風味營養品質差異化市場需求，適當調整和細化個別工藝條件，生產加工不同風味品質的差異化產品提供依據。