礦物元素結合穩定同位素的中華絨螯蟹產地溯源

張政權，黃冬梅*，蔡友瓊，孟憲菁，史永富，孔 聰，黃宣運，湯云瑜，張 璇，楊光昕

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部遠洋與極地漁業創新重點實驗室，上海 200090；3.賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海 201206）

中華絨螯蟹又稱河蟹、大閘蟹，屬于日本絨螯蟹中華亞種，因其風味獨特且營養豐富，在我國深受廣大消費者的歡迎。自二十世紀七十年代中期以來，中華絨螯蟹在我國的養殖產量迅速增長，目前已經成為我國最主要的水產品之一。中華絨螯蟹的養殖主要集中在遼河、黃河和長江三大水系中[1]，據消費者多年的反饋，長江水系養殖的河蟹無論在口感風味還是個體大小上都相對較好，尤其是以陽澄湖出產的大閘蟹最負盛名，每年大閘蟹上市的季節，陽澄湖大閘蟹都是消費者爭相品嘗的對象。而現在無論網絡上還是水產市場上都能夠看到“原產自”陽澄湖的大閘蟹，其中大多數無疑為不良商家為了獲取更高利潤假冒陽澄湖大閘蟹進行銷售，這不僅損害了消費者和當地養殖戶的利益，同時還對地區品牌構成了嚴重威脅。為了規范水產養殖市場秩序，保護消費者和養殖戶的合法權益，建立完善的河蟹防偽判別體系，追溯假冒偽劣產品源頭至關重要。

傳統的水產品產地溯源方法是添加物理防偽標簽[2]，這種方式一定程度上能夠做到對不同來源的產品進行區分，但也存在一些不足，這些獨立于產品之外的防偽標識在加工運輸過程中容易造成標簽的脫落或損壞導致信息鏈中斷，同時虛假標簽的使用更是會讓防偽標簽形同虛設。因此，急需開發一種新的水產品產地溯源方式，能夠反映水產品產地的環境特征和水產品自身的飲食特征，而礦物元素和穩定同位素豐度是目前最能反映這些特征的因素。目前國內外采用礦物元素和穩定同位素技術對茶葉[3-4]、稻米[5-8]、豆類[9-10]、牛羊肉[11-17]等農產品的產地溯源已有一些研究報道，對中華絨螯蟹進行產地溯源的研究，主要集中在對其外部形態和風味特征方面差異性的比較[18-21]，這種研究方式存在很大的局限性，且含主觀因素較多，對外部形態相近的水產品很難進行區分，也有學者通過脂肪酸含量[22]、礦物元素含量[23-24]等方面對不同地區的中華絨螯蟹進行了區分，但僅局限于采用單一技術對中華絨螯蟹溯源的研究，暫未發現采用礦物元素與穩定同位素結合的方式對長江水系的中華絨螯蟹進行產地溯源。本研究采用礦物元素含量和穩定同位素豐度結合的方式，比較長江水系中陽澄湖、崇明和興化3 個地區河蟹的8 種礦物元素的含量和C、N穩定同位素豐度，利用SPSS 19.0數據處理軟件對所得數據進行方差分析和顯著性比較，利用聚類分析對3 個地區的樣品進行了初步聚類，利用線性判別分析對樣品進一步歸類比較，并建立產地判別模型，然后利用主成分分析篩選出能夠區分3 個地區河蟹的特征指標，以期實現對中華絨螯蟹的產地溯源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河蟹樣品由養殖戶協助于2019年7月分別于陽澄湖中、興化養殖塘和崇明養殖塘捕撈，雌蟹和雄蟹各10 只，質量范圍在63～107 g之間，每個樣品分別用自封袋封裝編號并立即運回實驗室（表1）。取其腿部及腹部肌肉混合均勻，將樣品放入真空冷凍干燥機連續干燥至恒質量后，研磨過100 目篩，放入干燥器中保存備用。

表1 河蟹樣品基本信息Table 1 Information about crab samples collected for this study and their geographical origins

硝酸（分析純） 江蘇晶銳化學股份有限公司；超純水、過氧化氫（分析純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；1 mg/mL K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu、Fe元素單標準液 國家標準物質認證中心；穩定同位素標準品USGS40 東莞市譜標實驗器材科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q ELEMENT超純水機 美國默克密理博 公司；FreeZone真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；JA5000C精密電子天平 常州市幸運電子天平有限 公司；ETHOS 1微波消解儀 意大利邁爾斯通公司；HP-H35SC電加熱板 盛達杰森自動化設備有限公司；ContrAA-700原子吸收光譜儀 德國耶拿分析儀器股份公司；EA IsoLink元素分析儀、DELTA V Advantage同位素比率質譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 元素測定

準確稱取0.5 g樣品于50 mL尖底離心管，加入5 mL硝酸和1 mL過氧化氫，放置于通風櫥酸解過夜，第2天將酸解后的樣品轉移至微波消解罐中放入微波消解儀中消解。將消解后的樣品放置加熱板上趕酸至溶液呈澄清并有白色煙霧冒出，取出放置至室溫，定容稀釋上機。樣品液經進樣管進入霧化器，經霧化成為水蒸氣進入原子化器，水蒸氣在原子化器內被空氣-乙炔混合氣體燃燒產生的高溫原子化，同時吸收光源產生的電磁輻射，電磁輻射能的吸收與蒸汽中被測元素的含量呈正比，通過最終測定的吸光度可以計算出待測元素的含量。本研究測定8 種礦物元素的標準曲線線性相關系數均在0.999以上，方法的回收率為96.0%～106.9%，精密度為1.1%～5.4%，各元素的方法檢出限分別為K 118.0 mg/kg、Ca 19.0 mg/kg、 Na 101.0 mg/kg、Mg 89.0 mg/kg、Mn 0.06mg/kg、Zn 0.70 mg/kg、Fe 0.44 mg/kg、Cu 0.10 mg/kg。

1.3.2 穩定同位素測定

用百萬分之一天平準確稱取400～450 μg蟹肉干粉包裹在錫紙杯里，依次放入進樣盤中，樣品通過自動進樣器進入EA IsoLink元素分析單元，在元素分析單元中燃燒并被還原成純凈的CO2和N2，經過ConFlo IV連續流接口裝置經氦氣稀釋后進入DELTA V Advantage穩定同位素質譜儀進行檢測。儀器條件如下：載氣流速180 mL/min，進樣口吹掃速率70 mL/min，氧氣流速175 mL/min，燃燒爐溫度980 ℃，還原爐溫度55 ℃，每測定20 個樣品插入2 個USGS40（咖啡因）標準品進行質量控制。CN穩定同位素的測試精度均優于0.1‰。

穩定性C、N同位素豐度分別表示為δ13C、δ15N，其中δ13C的相對標準為V-PDB（維也納-PeeDee箭石標準），δ15N的相對標準為空氣中的N2。計算公式如下：

式中：R為重同位素與輕同位素的豐度比，即13C/12C、15N/14N。

1.4 數據處理軟件

采用SPSS 19.0數據處理軟件對實驗結果進行方差分析、顯著性比較、系統聚類分析、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和主成分分析（principal component analysis，PCA），采用SPSS 19.0作樣品分布散點圖。

2 結果與分析

2.1 元素含量和穩定同位素豐度產地差異分析

如表2、3所示，8 種元素和2 種穩定同位素在3 個地區的樣品中呈現不同程度的差異。單因素方差分析和Duncan多重比較分析結果顯示K、Mg、Cu三種元素在3 個地區間均存在顯著差異（P＜0.05），且K和Cu在崇明地區的樣品中含量最高，Mg在陽澄湖地區的樣品中含量最高。Na在崇明和興化地區的樣品中含量差異不顯著 （P＞0.05），但Na在兩地區樣品中的含量均明顯高于陽澄湖地區（P＜0.05）。Ca和Zn在崇明和興化2 個地區樣品中的含量差異不顯著（P＞0.05），且均顯著低于陽澄湖地區（P＜0.05）。而Fe、Mn和δ15N在崇明和陽澄湖2 個地區樣品中的含量差異不顯著（P＞0.05），但均顯著高于興化地區（P＜0.05）。δ13C在陽澄湖與興化兩地區樣品中差異不顯著（P＞0.05），且都顯著高于崇明地區（P＜0.05）。鑒于三地區樣品中8 種礦物元素含量和C、N穩定同位素豐度的差異，表明利用這種差異區別三地區的樣品具有一定的可行性。

表2 礦物元素含量（干質量）測定結果Table 2 Mineral element contents of crab samples mg/kg

表3 穩定同位素豐度測定結果Table 3 Stable isotope abundance in crab samples‰

2.2 聚類分析

圖1 3 個地區樣品的系統聚類結果Fig. 1 Systematic clustering resultsof three regional samples

為觀察礦物元素與穩定同位素結合在對三地區樣品歸類方面的能力，將這8 種元素和C、N穩定同位素豐度作為共同變量采用系統聚類方式對三地區的60 個樣品進行聚類，聚類結果（圖1）顯示，在歐式距離為6處將樹狀圖切斷，可將樣品大致分為兩大類，第1大類22 個樣品中有16 個為興化地區樣品，6 個為陽澄湖地區樣品，興化地區樣品占總數的72.7%，占興化地區樣品總量的80.0%，第2大類30 個樣品中有16 個為崇明地區樣品，占樣品總量的53.0%，占崇明地區樣品總量的80%，11 個為陽澄湖地區樣品，占樣品總量的36.7%，占陽澄湖樣品總量的55.0%，3 個為興化地區樣品，另外有1 個興化樣品、3 個陽澄湖地區樣品和4 個崇明地區樣品被錯誤分成了3 小類。聚類分析結果總體上將興化地區樣品單獨聚為一類，將陽澄湖和崇明地區樣品共同聚為一類，顯示綜合礦物元素和穩定同位素在對3 個地區的樣品進行探索性聚類方面表現出一定的能力，但是聚類效果還不夠理想，存在較多的誤判樣品。

2.3 LDA結果

LDA是一種有監督的數據歸類方式，可以在假設樣品分類的基礎上把已知樣品作為訓練集，利用各類樣品之間的相關性建立判別模型，從而可以利用判別模型對未知樣品進行判別歸類，還可以采用“留一法”交叉驗證把訓練集中的除某一個樣品之外的其余樣品作為訓練集，建立相關的判別函數對該樣品進行判別，在這個過程中，總樣品中的每一個個體都被除該個體之外的樣品建立的判別函數進行驗證，從而極大地檢驗了判別模型的穩定性。本研究采用步進式DA方法，按照每個變量在判別分析過程中的重要性由大到小逐步選為判別變量，建立分類判別函數。如表4所示，崇明和興化地區的樣品實現了全部100%的正確分類，陽澄湖地區的樣品有1 個被誤判為崇明地區，正確判別率為95.0%，三地區樣品的總體正確判別率為98.3%，交叉驗證結果中陽澄湖地區的1 個樣品被誤判到崇明地區，雖然3 個地區中有個別樣品出現了誤判，其總體的交叉驗證判別正確率仍然高達98.3 %。

表4 LDA及交叉驗證結果Table 4 LDA and cross-validation results

本次判別分析采用礦物元素結合穩定同位素建立2 個典型判別式函數，其中函數1的方差貢獻率為88.9%，函數2的方差貢獻率為11.1%，利用這2 個判別函數分別作為橫縱坐標建立坐標系，得到3 個組的散點圖，由圖2可以直觀地看出3 個地區的所有60 個樣品均被明顯分為3 個區域。說明本次判別分析建立的判別函數對來自3 個地區的樣品具有很好的分類效果。

圖2 典型判別式函數分類圖Fig. 2 Good classification of three regional samples with typical discriminant functions

2.4 PCA結果

PCA運用數學降維的分析方式，能夠將幾組具有相關性或相似性質的變量合并為一組，選取主要成分，減少分析變量，最終實現簡化判別模型的目的。本研究通過設置特征值大于1的成分作為PC，最終篩選出4 個PC，累計方差貢獻率為74.8%，其中PC1主要綜合了K、δ15N的信息，PC2中主要綜合了Mg、Ca的信息，PC3中的主要貢獻元素為Mn、Fe，PC4中的主要貢獻元素為Na、Zn。通過比較各個主成分組合對樣品的分類效果，選取PC1、PC2、PC4分別作為Z軸、Y軸和X軸作散點圖，得到三地區樣品在三維坐標系中的空間分布圖，由圖3可以看出，3 個地區的樣品分別分布在空間坐標系的3 個不同的區域，PCA結果表明，采用PC1、PC2、PC4可對三地區的樣品實現正確分類，說明K、Mg、Ca、Na、Zn和δ15N是區分3 個地區河蟹的特征指標。

圖3 三地區樣品在PC坐標系中的分布Fig. 3 Distribution of three regional samples in the PC coordinate system

3 討 論

由于生物體本身不能合成礦物元素，其體內的礦物元素含量均來自日常飲食和其生長的環境中[25-26]，因此兩者之間存在顯著相關性，這就為利用礦物元素區分不同地區的水產品提供了理論基礎，郭利攀等[27]利用電感耦合等離子體質譜儀和原子吸收光譜測定東海3 個地區經濟魚類的25 種金屬元素，采用偏最小二乘-判別分析對3 個地區的樣品實現了97.92%的正確分類，并且通過主成分分析篩選出對魚類產地區分影響最為顯著的礦物元素，在自然狀態下，生物體內的穩定同位素組成由于氣候、環境和生物代謝類型等影響因素發生自然分餾效應而存在一定的差異[28-29]，這種差異是生物體一種自然屬性，可為區分不同來源的生物提供判別依據。郭捷敏等[30]比較了野生和人工養殖環境中的紅樹林青蟹的C、N穩定同位素組成，發現野生環境下的青蟹與人工養殖環境下的青蟹具有不同的C、N穩定同位素組成，可作為青蟹產地區分的主要依據。馬冬紅等[31]利用氫穩定同位素對我國廣東、海南、廣西和福建4 個地區的羅非魚實現了85%的判別正確率，Sant’Ana等[32]發現C、N穩定同位素指標的結合在無論雨季還是旱季都能夠對巴西淡水鯰魚提供很好的溯源效果，在本研究中，N穩定同位素在區分3 個地區的樣品時表現出一定的優勢，δ15N在3 個地區蟹肉中的含量由大到小為陽澄湖＞崇明＞興化，通過對3 個地區河蟹人工餌料和池塘底泥中N穩定同位素的測定，發現3 個地區餌料中δ15N豐度比由大到小為陽澄湖（3.78）＞崇明（2.95）＞興化（2.20），底泥中δ15N豐度比由大到小為陽澄湖（9.46）＞崇明（3.35）＞興化（1.60），雖然河蟹在長期的飼養過程中攝入食物的種類較為復雜，除了人工餌料還可能攝入養殖水域中其他小型魚類和植物，但本研究證實了δ15N在3 個地區的蟹體、餌料和底泥中呈現顯著相關性，表明環境和飲食方面的N攝入對蟹體中δ15N具有積極的影響，從而為利用δ15N對不同地區河蟹的區分提供了有力的證據，通過將穩定同位素豐度與礦物元素含量結合對3 個地區的樣品實現了98.3%的正確分類。這些結果表明，不管是采用多種礦物元素還是采用礦物元素與穩定同位素結合的方法都能夠產生很好的判別效果，并且采用礦物元素和穩定同位素相結合的方法能更好地提高判別模型的穩定性。

多元統計分析能夠在多個對象和多個指標相互關聯的情況下分析它們的統計規律，其主要內容包括多元線性回歸分析、PCA與因子分析、DA與聚類分析[33]。近年來隨著科研工作的深入，多元統計分析在食品的產地溯源領域得到了越來越廣泛的應用[34-35]。本研究采用8 種礦物元素和2 種穩定同位素作為變量，對崇明、興化和陽澄湖3 個地區的河蟹進行方差分析和顯著性比較，發現各變量在3 個地區的樣品都存在不同程度的差異，同時聚類分析和LDA在對3 個地區的樣品分類方面也取得了良好的效果，聚類分析大體上將興化地區的樣品分為一類，將陽澄湖和崇明的樣品共同歸為一類，這可能是因為陽澄湖和崇明兩個地區在地理位置上距離較近，環境條件相似所致，LDA對3 個地區樣品的交叉驗證判別正確率為98.3%，證明線性判別分析對三地區河蟹的判別分類具有很好的效果。PCA最終篩選出4 個主成分，利用不同元素在各個PC中的載荷及各元素在3 個地區樣品中含量的差異性，最終選取了PC1、PC2和PC4成功將3 個地區的樣品分成了3 個不同的區域，從而提取出K、Mg、Ca、Na、Zn和δ15N 6個特征變量，為判別模型的優化提供了方向。

4 結 論

本研究利用原子吸收光譜儀和穩定同位素比率質譜儀分別測定了崇明、陽澄湖和興化3 個地區河蟹肌肉組織中的8 種礦物元素含量和C、N穩定同位素豐度，結果顯示，這8 種元素和2 種穩定同位素豐度在3 個地區間存在不同程度的差異，其中K、Mg和Cu這3 種元素在3 個地區間都存在顯著差異（P＜0.05），系統聚類結果整體上將興化地區的樣品單獨歸為一類，將陽澄湖和崇明樣品共同歸為一類，采用LDA對3 個地區的樣品建立判別模型，得到崇明、陽澄湖、興化三地區樣品的初始判別正確率分別為100%、95%和100%，整體初始判別正確率為98.3%，交叉驗證結果為98.3%，表明采用這8 種礦物元素建立判別模型可以對3 個地區的樣品實現正確區分。利用PCA篩選出4 個PC，主要貢獻元素為K、Mg、Ca、Na、Zn和δ15N，這4 個PC的累計方差貢獻率為74.8%，選用PC1、PC2、PC4建立坐標系，繪制散點圖，對三地區的樣品實現了正確區分。本研究結果表明，礦物元素結合穩定同位素的分析技術對中華絨螯蟹的產地溯源具有一定的優越性，可以為全國范圍內的河蟹產地溯源鑒別提供理論基礎和方法參考。