離體肝臟常溫機械灌注設備對紅細胞影響的實驗研究

何錫然，黃小桃，譚曉宇，張琳，劉華敏，鄺偉鍵，梁銘炬，周偉津，郭家钘，陳素平，霍楓

1. 廣東順德工業設計研究院（廣東順德創新設計研究院），廣東 佛山 528311；2. 中國人民解放軍南部戰區總醫院 肝膽外科，廣東 廣州 510010；3. 廣東丁沃生醫療器械有限公司，廣東 佛山 528311

引言

肝移植是治療終末期肝臟疾病的有效方法。然而由于供肝來源相對匱乏，嚴重限制了該項技術的臨床應用。數據顯示，美國每年新增肝移植等待者約10000人，等待者常年超過15000人，但每年僅能完成6000例移植手術[1]。我國是肝病大國，終末期肝病患者達800萬，每年約30萬人死于終末期肝病，其中只有不到1%患者獲得肝移植機會[2]。為了解決供肝需求問題，以往認為風險較大的邊緣供體或者擴大標準供體逐漸用于臨床。邊緣供肝包括高齡、心死亡、器官功能嚴重異常等供體來源的供肝，也包括長時間冷保存和中重度脂肪變性等的供肝[3]。因為缺乏科學有效的評估手段，邊緣供肝的質量難以評價以至于棄用率較高[4]，使用后對移植受者預后影響較大[5]。雖然傳統靜態冷保存可以降低組織代謝和氧需求量延長保存時間，但同時也導致細胞水腫和細胞損傷[6]。邊緣供肝長時間的冷保存，移植失敗風險和受體死亡率顯著增加[7]。已有研究認為常溫機械灌注技術（Normothermic Machine Perfusion，NMP）可以減少供肝冷保存損傷[7]，并評價供肝質量[8-9]。此外，NMP通過灌注液為器官供氧和提供代謝底物的同時，可以添加保肝護肝藥物，有可能對供肝損傷起到修復作用[10]。目前國內還沒有市場化的肝臟NMP設備，國外也僅處于獲得歐盟認證階段。本項目組構建了離體肝臟NMP設備。目前常溫機械灌注最常用的氧載體為紅細胞[11]，本研究對設備在灌注過程中對紅細胞的影響進行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.1.1 實驗動物

選取清潔級健康雌性巴馬小型豬6只，體重45～50 kg，由解放軍南部戰區總醫院動物實驗中心提供。每頭實驗豬作為血液和肝臟的供體。所有動物均符合南部戰區總醫院動物實驗倫理委員會要求，在動物實驗中心飼養和實驗操作。

1.1.2 實驗設備

常溫機械灌注設備DEVOCEAN-LIVER 2000，該設備由廣東順德工業設計研究院（廣東順德創新設計研究院）、解放軍南部戰區總醫院、廣東丁沃生醫療器械有限公司聯合研發。該裝置可對離體肝臟進行肝動脈和門靜脈雙重灌注。設備主要構建部件有：2個離心泵（Revolution Centrifugal Pump，Sorin Group Italia S.r.l.）；2個 氧 合 器（EUROST EU5032 TRILLY Infant-Paediatric Oxygenator，EUROSETS S.r.l.）；溫度傳感器（精密型，佛山市亨遠電子有限公司）；2個壓力傳感器（洛瑞，深圳市順美醫療股份有限公司）；2個流量傳感器（co.56/080，SONOTEC GmbH）；2個濾血栓（兒童，東莞科威醫療器械有限公司）；膽汁計數器；溫控水浴箱；自制的儲肝器、自制的灌注管路以及自制門靜脈、肝動脈、膽管連接管路等。各部件連接方式如圖1所示。

圖1 離體肝臟常溫機械灌注系統示意圖

1.1.3 儀器與試劑

呼吸機（S1100型，南京舒普思達醫療設備有限公司）、多參數監護儀（M-9000S，深圳市艾瑞康醫療設備有限公司）、全自動雪花制冰機（IMS-70，常熟市圣海電器有限公司）、全自動生化分析儀（Pointcare M3，天津微納芯科技有限公司）、雅培i-STAT300血氣分析儀（美國雅培）、電子稱（HY-809B，至尊）、一次性醫用靜脈留置針（24G，江西豐臨醫用器械有限公司）、導尿管（16Fr雙腔，湛江事達實業有限公司）、硫酸阿托品注射液（天津金耀藥業有限公司）、舒泰50（法國維克有限公司）、丙泊酚乳狀注射液（西安力邦制藥有限公司）、高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液（上海輸血技術有限公司）、肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫藥集團有限責任公司）、羥乙基淀粉130/0.4電解質注射液（山東齊都藥業有限公司）、注射用頭孢西丁鈉（國藥集團致君（深圳）制藥有限公司）、注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（P fizer Manufacturing Belgium NV）。

1.2 豬血液及肝臟獲取

實驗豬耳后肌內注射硫酸阿托品注射液0.05 mg/kg，15 min后耳后肌肉注射舒泰50 2～3.5 mg/kg進行基礎麻醉。誘導麻醉后，豬耳緣靜脈留置套管針建立輸液通道，利用微量注射泵以每小時2～5 mg/kg的劑量泵入丙泊酚進行維持麻醉。氣管插管，連接呼吸機，維持動物正常呼吸。

腹部正中線大切口進腹，游離腹主動脈、下腔靜脈及門靜脈。經耳緣靜脈注射25000 U肝素鈉，隨后于腹主動脈和下腔靜脈置入自制16-Fr導管，利用內含12500 U肝素鈉和8 mL生理鹽水的儲血袋收集血液。血液收集過程自動過濾去除白細胞。

靜置實驗豬60 min（即熱缺血60 min）后，結扎胸主動脈，腹主動脈插管，備4℃高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液1 L；同時進行門靜脈插管，備4℃高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液1 L；剪開肝靜脈出口，進行在體冷灌注?？焖偃∠赂闻K，置入含4℃生理鹽水的容器。修整肝臟后，進行肝動脈和膽道插管。

1.3 常溫機械灌注液和常溫機械灌注參數設定

所有離體肝臟均采用常溫機械灌注，灌注時間為8 h。

NMP灌注液配制：灌注液總體積為1500 mL，包括豬全血，羥乙基淀粉130/0.4電解質注射液，800 U肝素鈉注射液，1 g注射用頭孢西丁鈉，500 mg注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉。

啟動灌注液循環即開始利用氧合器供氧，給氧濃度為60%，氣體流量與血液流量之比為1：1，氧分壓在300～350 mmHg。肝動脈和門靜脈連接管分別按圖1所示連接循環管路。灌注溫度為37℃，肝動脈灌注壓力設定為80/60 mmHg，門靜脈灌注流量按照肝臟重量設定為0.5 mL/[min·g（肝重）]。

1.4 觀察指標

灌注過程，設備自動記錄灌注液溫度、肝動脈流量和門靜脈流量。灌注開始時及之后每小時取適量灌注液，化驗紅細胞壓積（Hematocrit，HCT）、血紅蛋白（Hemoglobin，HGB）、總膽紅素（Total Bilirubin，TBIL）、間接膽紅素（Indirect Bilirubin，IBIL）、溶血率、乳酸（Lactate，Lac）以及血糖（Glucose，Glu）等。

1.5 統計學方法

采用SPSS23.0統計學軟件進行統計學分析。所有計量資料以均數±標準差（>±s）表示。樣本服從正態分布，采用配對t檢驗灌注前后差異，若樣本不服從正態分布則采用非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 物理參數

灌注過程中，灌注液溫度穩定在37 ℃。肝動脈初始流量最低值為（54.64±11.94） mL/min，隨著灌注過程延長，最高達到（249.34±93.01） mL/min。門靜脈采用恒流模式控制，流量平均值穩定在（442.67±79.19） mL/min。結果如圖2所示。

圖2 灌注溫度和流量

2.2 HCT與HGB水平

灌注開始時HCT為（27.67±2.42）%，灌注8 h HCT為（28.00±2.45）%，兩者相比，無統計學差異（P＞0.05）。灌注初期HGB為（9.40±0.81）g/dL，灌注8 h為（9.52±0.81）g/dL，兩者相比無統計學差異（P＞0.05）。結果詳見圖3。

2.3 膽紅素水平

灌注開始時TBIL為（4.43±1.36）μmol/L，灌注8 h TBIL為（4.40±1.67）μmol/L，兩者水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。IBIL在灌注開始時為（1.43±1.04）μmol/L，灌注8 h為（1.73±0.47）μmol/L，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。TBIL和IBIL在灌注過程中未見明顯升高，結果如圖4所示。

圖3 灌注液的HCT和HGB

圖4 灌注液的膽紅素水平

2.4 溶血率

灌注開始和之后每小時化驗灌注液樣本，均顯示無溶血，各時間點溶血率均為0，見表1。

表1 灌注過程中的溶血情況

2.5 Lac和Glu水平

灌注過程中，初期Lac水平為（2.52±0.39）mmol/L，灌注8 h Lac為（0.35±0.07） mmol/L，數據比較，具有統計學差異（P＜0.05）。葡萄糖灌注開始時為（14.62±5.12） mmol/L，灌注1 h水平最高，為（21.37±5.96） mmol/L，灌注8 h為（9.78±2.63） mmol/L，灌注8 h與灌注開始以及灌注1 h相比，差異均具有統計學意義（P＜0.05），結果如圖5所示。

圖5 灌注液的Lac和Glu水平

3 討論

常溫下離體肝臟NMP是近年來器官移植領域研究的熱點。該技術與低溫機械灌注或傳統冷保存不同，灌注液主要使用全血或紅細胞懸液。因此機械灌注過程中，磁懸浮驅動灌注液進行長時間循環，是否會造成紅細胞溶血、破壞抑或消耗，是否可能導致紅細胞攜氧能力下降，是否會影響離體肝臟功能等問題，對設備實驗或臨床應用至關重要。

臨床上反映紅細胞損耗的指標常用HCT、HGB和溶血率。HCT是指血細胞在血液中所占容積的比值，反映紅細胞的增多或減少[12]。HGB是一種結合蛋白，是血液中紅細胞攜帶、運輸氧氣和二氧化碳的載體。血液中98.5%的氧氣是與HGB結合成氧合HGB的形式存在和運輸的[13]。溶血則是指紅細胞破裂，HGB逸出。機械性強力振動是溶血的常見原因之一。本研究利用自主構建的常溫機械灌注設備進行小型豬離體肝臟灌注實驗，過程中對這三個指標進行動態檢測，結果顯示持續灌注8 h對HCT、HGB水平沒有影響，不會導致溶血。

為了進一步了解紅細胞攜氧能力及灌注過程是否能改善離體肝臟功能，本研究在實驗過程動態檢驗灌注液TBIL、IBIL、Lac和Glu的水平，并監測肝動脈和門靜脈流量。膽紅素是血液循環中衰老紅細胞在肝、脾及骨髓的單核-吞噬細胞系統中分解和破壞的產物，人體中由紅細胞破壞產生的膽紅素占TBIL的80%～85%，當紅細胞破壞過多時可引起膽紅素代謝障礙，當TBIL增高伴IBIL明顯增高提示為溶血性黃疸[14]。本實驗灌注過程中，TBIL和IBIL均比較平穩，未見明顯波動，進一步證明了項目組構建的設備不會導致溶血。血中Lac增多是組織嚴重缺氧時，糖分解代謝中的丙酮酸無氧酵解途徑生成Lac作用加強所致[15]。在氧供充足的情況下，葡萄糖進行有氧氧化，生成二氧化碳和水，在缺氧情況，葡萄糖進行無氧酵解，生成Lac[16]，提示Lac和葡萄糖水平可作為組織缺氧的指標，間接證明紅細胞的攜氧能力。本研究灌注過程中，Lac和葡萄糖均被明顯消耗，間接提示了本研究灌注液中紅細胞具有較好的攜氧能力，能夠改善離體肝臟功能。

Banan等[17]利用豬為動物模型，研究離體肝臟機械灌注系統對不同熱缺血損傷的肝臟的保存效果，他們將灌注液HCT控制在15%～20%，結果發現NMP能夠穩定轉氨酶水平，同時可以增加膽汁生成和降低Lac水平，組織學評價顯示NMP能夠改善壞死和缺血再灌注損傷。Bral等[18]利用動物模型研究不同HGB水平灌注效果，發現HGB在20～30 g/L之間有助于降低Lac和Lac脫氫酶。Watson等[19]使用荷蘭的liver assist儀器進行常溫機械灌注對廢棄人肝進行研究，灌注液中的HGB水平和HCT分別設定為6.1 g/dL（范圍：5.1～7.4）和18%（范圍：16%～22%），結果顯示該常溫灌注條件能夠對肝臟進行有效評價，并且肝臟能夠進行肝移植手術。以上研究顯示，目前尚無統一的常溫機械灌注HCT標準。

Bral等[20]使用OrganOx公司的常溫機械灌注設備對人肝臟進行離體灌注臨床研究，該常溫灌注的HGB水平為（104±18）g/L，HCT水平為（32±5）%，平均灌注時間為11.5 h，結果顯示所有肝臟在移植后均能發揮功能，證明了常溫灌注技術的安全性。Den Dries等[21]利用liver assist對四個廢棄人肝進行了常溫灌注，在該研究中，灌注前、灌注 30 min和灌注6 h的HGB 水平分別為（4.7±0.1） mmol/L，（3.8±0.1）mmol/L，（3.9±0.2） mmol/L，而HCT水平則為（0.23±0.01）%（，0.19±0.01）%，（0.20±0.01）%，灌注結果顯示NMP能夠顯著降低Lac水平，改善肝細胞功能，同時也提示常溫灌注需要穩定的HCT和HGB水平。本研究數據顯示我們構建的設備能夠將灌注液HCT、HGB、TBIL和IBIL維持在一個穩定的水平，灌注液溶血率為0，而且可以改善灌注液Lac和Glu水平。此外，灌注過程中，肝動脈流量逐漸增加，提示肝臟血管阻力下降、微循環改善，也間接反映了肝臟質量改善。

4 結論

灌注過程，HCT、HGB、TBIL和IBIL均能維持穩定，而且每小時的溶血率均為0，提示設備能夠在灌注過程中穩定紅細胞的數量。持續的Lac和葡萄糖消耗，間接提示紅細胞的攜氧能力有助于改善肝功能。但是評價紅細胞的功能需要檢測更多指標，如紅細胞變形能力、游離HGB水平、網織紅細胞計數、血小板、外周血細胞活化特異性釋放產物等。同時今后將會開展更長時間的灌注時間，包括12 h和24 h，以進一步評價設備在長時間灌注時對紅細胞的影響。另外，將設計實驗探討不同HCT水平的灌注液對離體肝臟的影響。