常溫機(jī)械灌注設(shè)備對(duì)供肝熱缺血損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉華敏，何錫然，譚曉宇，張琳，鄺偉鍵，梁銘炬，周偉津，郭家钘，陳素平，黃小桃，霍楓

1. 廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院），廣東 佛山 528311；2. 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510010；3. 廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司，廣東 佛山 528311

引言

肝移植是終末期肝病最有效的治療方法，由于供體器官的短缺，該技術(shù)的發(fā)展受到嚴(yán)重制約。為擴(kuò)大供應(yīng)器官來源，心臟死亡供體捐獻(xiàn)（Donation After Circulatory Death，DCD）逐漸受到重視。但DCD供肝在獲取前經(jīng)歷了低灌注、缺氧的過程，造成不同程度的熱缺血損傷，增加了移植后原發(fā)性肝無功（Primary Nonfunction，PNF）和膽管性病變等并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[1-4]。使用傳統(tǒng)的靜態(tài)冷保存（Static Cold Storage，CSC）方法將會(huì)進(jìn)一步加重DCD供肝損傷[5-6]，致使很多的供肝廢棄。因此，在擴(kuò)大供肝來源的同時(shí)，離體器官的保存和維護(hù)的方式被賦予更高的要求。

隨著體外機(jī)械灌注技術(shù)的發(fā)展，研究者使用常溫機(jī)械灌注（Normothermic Machine Perfusion，NMP）技術(shù)改善、擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供體器官的保存狀態(tài)[7]。NMP是以機(jī)械方式在生理溫度下為器官提供血液灌注和氧供，保證氧氣和營養(yǎng)的供給，恢復(fù)細(xì)胞代謝的一種技術(shù)[7-9]。NMP保證了離體肝臟的正常代謝，維持肝臟的正常生理狀態(tài)，避免冷藏，且能夠進(jìn)行肝臟功能檢測(cè)。近年來，NMP已經(jīng)取得明顯的進(jìn)展，歐洲和北美已發(fā)展到臨床試驗(yàn)階段[10-11]，臨床前實(shí)驗(yàn)證明了該技術(shù)具有安全性和可靠性[12-13]。目前國內(nèi)還沒有市場(chǎng)化的肝臟NMP設(shè)備，國外也僅處于獲得歐盟認(rèn)證階段。基于國內(nèi)供肝日趨緊缺，越來越多邊緣性供體用于臨床移植，而國內(nèi)NMP設(shè)備尚在探索階段，因此本項(xiàng)目組自主研發(fā)了一套新型的離體肝臟NMP設(shè)備，擬通過構(gòu)造DCD 30 min和DCD 60 min實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停醪教骄吭撛O(shè)備保存豬DCD肝臟的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康巴馬小型豬9只，雌性，體重40～50 kg，由中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)操作過程嚴(yán)格遵照中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.1.2 NMP設(shè)備

NMP設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000，該設(shè)備由廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院）、解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院、廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司聯(lián)合研發(fā)。該設(shè)備可對(duì)離體肝臟進(jìn)行肝動(dòng)脈和門靜脈雙重灌注。主要構(gòu)建部件有：2個(gè)離心泵頭（Revolution Centrifugal Pump，Sorin Group Italia S.r.l.）；2個(gè) 氧 合 器（EUROST EU5032 TRILLY Infant-Paediatric Oxygenator，EUROSETS S.r.l.）；1個(gè)溫度傳感器（精密型，佛山市亨遠(yuǎn)電子有限公司）；2個(gè)一次性使用壓力傳感器（洛瑞，深圳市順美醫(yī)療股份有限公司）；2個(gè)流量傳感器（co.56/080，SONOTEC GmbH）；2個(gè)一次性使用動(dòng)脈微栓過濾器（兒童，東莞科威醫(yī)療器械有限公司）；溫控水浴箱；自制儲(chǔ)肝器、自制灌注管路以及自制門靜脈、肝動(dòng)脈、膽管插管等構(gòu)成，通過管路連接形成肝動(dòng)脈循環(huán)和門靜脈循環(huán)。在中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)室常溫狀態(tài)下對(duì)豬DCD肝臟進(jìn)行常溫灌注如圖1所示。

1.1.3 NMP灌注液的配制

總體積為1.5 L，包括豬全血，羥乙基淀粉130/0.4電解質(zhì)注射液，800 U肝素鈉注射液，1 g注射用頭孢西丁鈉，500 mg注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉。灌注過程的藥物添加如下：① 鹽酸維拉帕米注射液0.25 mg/h經(jīng)肝動(dòng)脈泵入；② 注射用尿激酶20萬單位經(jīng)肝動(dòng)脈泵入；③50 mL復(fù)方氨基酸注射液混合復(fù)合維生素注射液2 mL，5 mL/h經(jīng)由門靜脈泵入；④ 胰島素10 U/h門靜脈泵入；⑤牛磺膽酸鈉（140 mg/mL）1 mL/h經(jīng)由門靜脈泵入。

圖1 離體肝臟NMP系統(tǒng)原理圖

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

所有實(shí)驗(yàn)豬的肝臟根據(jù)熱缺血時(shí)間分為兩組，分別為DCD 60 min組（n=5）和DCD 30 min組（n=4）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豬血液及肝臟獲取

在耳后肌肉注射0.05 mg/kg硫酸阿托品注射液，15 min后按照 1～2 mg/kg的量注射舒泰50，進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉。麻醉成功后，肌肉注射 5 mg 咪達(dá)唑侖注射液。誘導(dǎo)麻醉后，耳緣靜脈留置套管針建立輸液通道。微量注射泵以每小時(shí)2～5 mg/kg的劑量泵入丙泊酚注射液維持麻醉。然后進(jìn)行氣管插管，連接呼吸機(jī)，潮氣量設(shè)定為10 mL/kg。腹部正中切口開腹，離斷肝周韌帶，橫斷并結(jié)扎膽總管，游離肝動(dòng)脈和門靜脈。經(jīng)耳緣靜脈注射25000 U肝素鈉注射液和2～3 mg鹽酸多巴胺注射液，隨后于腎門水平以下的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈分別置入16-Fr導(dǎo)管進(jìn)行血液的收集，血液儲(chǔ)存袋預(yù)先加入12500 U肝素鈉和8 mL生理鹽水混合液進(jìn)行抗凝。將收集的血液進(jìn)行過濾，去除全血中的白細(xì)胞。以血液引出的當(dāng)刻為熱缺血時(shí)間計(jì)時(shí)起點(diǎn)，靜置實(shí)驗(yàn)豬60 min或30 min。熱缺血時(shí)間結(jié)束后，結(jié)扎胸主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈插管，用1 L，4℃的高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液灌注液進(jìn)行在體冷灌注。同時(shí)，進(jìn)行門靜脈插管，灌注1 L，4℃的高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液灌注液。快速取下肝臟并置入無菌保護(hù)袋中，稱量肝重，然后移至含冰生理鹽水的儲(chǔ)肝器中進(jìn)行修肝，最后在肝動(dòng)脈和膽道置入連接設(shè)備的導(dǎo)管。

1.3.2 NMP

開始灌注之前灌注管路內(nèi)用羥乙基淀粉130/0.4電解質(zhì)注射液混合部分全血進(jìn)行預(yù)充，排除管路中的氣泡。隨后加入全血、肝素鈉注射液、注射用頭孢西丁鈉和注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，開始供氧。將修整好的肝臟連接設(shè)備。記錄冷缺血時(shí)間（從在體冷灌注至機(jī)械灌注開始所需的時(shí)間）。肝動(dòng)脈采用壓力控制模式灌注，收縮壓力設(shè)定為80 mmHg，舒張壓設(shè)定為60 mmHg。門靜脈采用流量控制模式灌注，流量設(shè)定為0.5 mL/[min·g（肝重）]。

1.3.3 監(jiān)測(cè)項(xiàng)目

灌注過程記錄肝動(dòng)脈流量、肝動(dòng)脈壓力、門靜脈流量以及門靜脈壓力，同時(shí)對(duì)灌注液行血?dú)饧吧治觯^察pH、血糖（Glucose，Glu）、乳酸（Lactate，Lac）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）、總膽紅素（Total bilirubin，TBIL）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-Glutamyl Transpeptadase，γGGT）濃度。記錄灌注過程中每小時(shí)產(chǎn)生的膽汁量，并檢測(cè)膽汁的pH、碳酸氫根水平（HCO3-）、葡萄糖、膽紅素和膽汁酸。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，樣本服從正態(tài)分布，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，若樣本不服從正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 灌注前參數(shù)

DCD 60 min組的平均冷缺血時(shí)間為（79.83±3.53 ）min，DCD 30 min組為（88.50±8.18） min，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。機(jī)械灌注前，DCD 60 min組灌注液的紅細(xì)胞比容（Hematocrit，HCT）為（31.17±1.01）%，DCD 30 min組的HCT為（31.00±0.58）%，兩組的HCT水平比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 物理參數(shù)

灌注過程中，兩組的肝動(dòng)脈壓力均維持在80/60 mmHg。兩組的肝動(dòng)脈流量水平接近，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組的門靜脈灌注流量均為0.5 mL/[min·g（肝重）]，而DCD 30 min組的門靜脈灌注壓力隨灌注時(shí)間延長呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在灌注的第6～12小時(shí)，兩組的門靜脈壓力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果如圖2所示。

2.3 血?dú)馍治?/h3>

灌注過程中，兩組的灌注液pH總體保持平穩(wěn)，未出現(xiàn)過酸或過堿的情況，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組的Lac代謝變化趨勢(shì)相似。在灌注1～6 h中，DCD 30 min組的Lac水平略高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），在灌注7 h至結(jié)束Lac水平均下降至2 mmol/L。在Glu代謝方面，兩組均表現(xiàn)良好。在灌注過程中葡萄糖持續(xù)消耗，兩組水平相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。在蛋白質(zhì)代謝方面，由于肝臟持續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)代謝，故兩組的BUN水平均持續(xù)升高，DCD 60 min組上升更高，兩組在第8、11、12 h水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果如圖3所示。

在肝功能方面，兩組的ALT和AST水平均在灌注開始后上升，而DCD 60 min組的水平較DCD 30 min組升高明顯，其中兩組的ALT水平從灌注2 h至灌注結(jié)束的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），AST水平自1 h 至灌注結(jié)束有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。在反映膽汁淤積損傷方面，兩組的ALP和γGGT水平相似（P＞0.05）。而兩組的TBIL水平除了在灌注1h有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其余灌注時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)果如圖4所示。

圖2 灌注參數(shù)

圖3 血?dú)馍笜?biāo)

圖4 血?dú)馍笜?biāo)

2.4 膽汁指標(biāo)

兩組在灌注過程均可持續(xù)生成膽汁，DCD 60 min組和DCD 30 min組灌注12 h的平均膽汁總量分別為（163.75±12.00） mL 和（159.75±10.96 ）mL（P＞0.05），兩組平均每小時(shí)生成膽汁量達(dá)10 mL以上。其中DCD 30 min肝臟在灌注0～2 h內(nèi)生成更多的膽汁（P＜0.05）。兩組的膽汁pH均呈弱堿性，在7.3～7.4，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。兩組的HCO3-水平，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），平均在10 mmol/L左右。兩組的膽汁葡萄糖水平均呈持續(xù)下降趨勢(shì)，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而膽汁的TBIL和膽汁酸濃度方面，兩組在灌注后期出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中DCD 30 min組在灌注8～12 h的TBIL濃度更高，在灌注10～12 h的膽汁酸濃度更高，結(jié)果如圖5所示。

圖5 膽汁指標(biāo)

3 討論

DCD供肝在獲取前因供體循環(huán)不穩(wěn)定而遭受較長時(shí)間的缺血、缺氧打擊，致使器官功能受損。目前，迫于日趨嚴(yán)重的器官短缺困境，DCD 供肝在移植中的使用不斷增多，由此引發(fā)的術(shù)后原發(fā)性無功能和缺血性膽病等嚴(yán)重并發(fā)癥也頻繁發(fā)生。對(duì)比傳統(tǒng)的CSC技術(shù)，NMP可以模擬肝臟的在體生理?xiàng)l件，維持離體肝臟組織正常機(jī)能及代謝環(huán)境。目前學(xué)界正嘗試使用NMP來改善DCD 來源供肝的保存狀態(tài)[7]。NMP潛在的器官修復(fù)能力也引起了許多學(xué)者的關(guān)注[9,14-15]。本研究基于此技術(shù)基礎(chǔ)搭建了新型NMP設(shè)備，并探討該設(shè)備對(duì)豬DCD供肝的保存效果。

目前，使用NMP技術(shù)進(jìn)行離體肝臟保存的灌注條件并不明確。但在肝移植中，學(xué)者們對(duì)小肝綜合征的研究結(jié)果指出過高的門靜脈壓力和門靜脈超灌是損傷肝臟損傷的主要原因[16]。本設(shè)備使用的是雙泵雙氧合灌注構(gòu)建，可以為門靜脈灌注富含氧供的血液，在較低的流量下供應(yīng)足夠的氧供。為保證設(shè)備中的DCD供肝免受門靜脈過灌和高壓的進(jìn)一步損害，我們選擇較低門靜脈流量進(jìn)行灌注，有研究報(bào)道正常肝臟血流量與肝重的比值約為1 mL/g[17]，門靜脈血供約為75%，因而我們選擇0.5 mL/g為門靜脈恒流灌注標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用了肝動(dòng)脈搏動(dòng)式恒壓控制和門靜脈持續(xù)恒流控制的灌注模式，在肝動(dòng)脈恒壓下，兩組的肝動(dòng)脈流量均呈現(xiàn)先升高，在中期達(dá)到峰值，隨后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這點(diǎn)與其他研究結(jié)果相似。如Vogel等[18]利用由牛津大學(xué)直屬公司研發(fā)的常溫灌注系統(tǒng)OrganOx對(duì)豬腦死亡肝臟進(jìn)行了48 h的常溫灌注，從肝動(dòng)脈流量的圖表看，肝動(dòng)脈流量在灌注前12 h呈下降趨勢(shì)。而在OrganOx系統(tǒng)更早的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，常溫灌注豬腦死亡肝臟72 h的肝動(dòng)脈流量在灌注前10 h亦呈下降趨勢(shì)[19]。Liu等[20]利用他們自主研發(fā)的灌注系統(tǒng)對(duì)DCD 60 min豬肝臟進(jìn)行10 h的常溫灌注，灌注過程中，肝動(dòng)脈流量亦出現(xiàn)波動(dòng)。綜合其他實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，肝動(dòng)脈流量在長時(shí)間灌注過程出現(xiàn)波動(dòng)屬于普遍現(xiàn)象。而在門靜脈保持0.5 mL/[min·g（肝重）]的恒流模式下，門靜脈壓力在灌注過程維持平穩(wěn)，壓力低于3 mmHg。Xu等[21]利用恒流模式進(jìn)行門靜脈灌注，流量為1.2～1.5 L/min，對(duì)應(yīng)的門靜脈壓力為5～8 mmHg。在另一個(gè)門靜脈恒流控制實(shí)驗(yàn)中，流量為1.5 L/min，對(duì)應(yīng)的壓力為5～10 mmHg[22]。綜合文獻(xiàn)的結(jié)果，在0.5 mL/[min·g（肝重）]的模式下，本研究的門靜脈壓力平穩(wěn)，未出現(xiàn)過低或者過高。但是兩組相比較，DCD 30 min組的門靜脈灌注阻力更低，可能與其損傷導(dǎo)致的細(xì)胞水腫更輕有關(guān)。本研究結(jié)果初步顯示在肝動(dòng)脈恒壓控制和門靜脈恒流控制模式下，自主研發(fā)的常溫灌注設(shè)備能夠穩(wěn)定維持灌注12 h的壓力和流量，灌注過程中未出現(xiàn)系統(tǒng)故障，表明了本設(shè)備長時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)的安全性和穩(wěn)定性。

供體器官質(zhì)量與熱缺血時(shí)間關(guān)系密切，因而熱缺血時(shí)間長短是供體受損程度評(píng)估的重要依據(jù)[23]。各個(gè)器官對(duì)熱缺血時(shí)間耐受程度略有不同，一般認(rèn)為供肝耐受熱缺血時(shí)間為30 min[10]。本研究中，在冷缺血時(shí)間可比的情況下，DCD 60 min肝臟的轉(zhuǎn)氨酶水平明顯高于DCD 30 min組，顯示出熱缺血時(shí)間越長，肝臟的損傷越重。同時(shí)兩組的ALT、AST水平在灌注過程中均呈現(xiàn)先升后逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì)，表明DCD供肝在本設(shè)備的支持維護(hù)下沒有進(jìn)一步加重?fù)p傷。以上研究結(jié)果表明，熱缺血時(shí)間越長對(duì)肝臟造成的損傷越嚴(yán)重，而NMP則可有效保存和維護(hù)DCD供肝[24-25]。

灌注過程中，兩組肝臟的Lac、Glu水平在上升后回落至穩(wěn)態(tài)，而BUN水平逐漸上升，表明了本設(shè)備能夠維持離體進(jìn)行有氧呼吸，糖代謝和蛋白質(zhì)代謝的生理功能。其中DCD 30 min肝臟的Lac水平在灌注初期較高，可能該類肝臟的活細(xì)胞數(shù)更多，冷缺血期無氧呼吸產(chǎn)生更多Lac。在灌注初期，由于缺血性再灌注損傷，更多有功能細(xì)胞進(jìn)行無氧呼吸，導(dǎo)致Lac水平升高。Liu等[20]研究亦出現(xiàn)Lac水平在灌注中期高隨后回落的趨勢(shì)，他們認(rèn)為可能是熱缺血結(jié)束灌洗后的殘余量。同時(shí)本研究也嘗試比較兩組供肝的Lac清除率，所用的公式為：6 h動(dòng)脈血Lac清除率=[（0 h動(dòng)脈血Lac水平-6 h動(dòng)脈血Lac水平）/0 h動(dòng)脈血Lac水平]×100%，但兩者的Lac清除率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

膽汁的產(chǎn)生是目前公認(rèn)的肝功能正常的指標(biāo)之一[26-27]。在本研究中，兩組肝臟均能持續(xù)生成膽汁，兩組平均每小時(shí)生成膽汁量達(dá)10 mL以上，提示肝細(xì)胞恢復(fù)了膽汁的合成和分泌功能正常[28]。對(duì)膽汁的成分進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，膽汁pH呈弱堿性，提示膽管細(xì)胞分泌碳酸氫根的功能正常；膽汁葡萄糖水平在灌注12 h下降到2.4 mmoL以下，提示膽管細(xì)胞恢復(fù)葡萄糖的重吸收功能；而膽汁膽紅素和總膽汁酸水平在灌注過程中逐漸增多，這是肝細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)化和分泌功能開始復(fù)蘇的標(biāo)志[29]。其中DCD 30 min組在灌注后期產(chǎn)生的膽汁品質(zhì)更好，提示在灌注后期DCD 30 min組的肝細(xì)胞功能較佳。可依據(jù)此類膽汁檢測(cè)指標(biāo)評(píng)估出肝功能較佳的肝臟。

綜上，本研究結(jié)果初步顯示自主研發(fā)的NMP設(shè)備在常溫灌注12 h內(nèi)能維持熱缺血損傷肝臟的功能。但本實(shí)驗(yàn)尚缺少肝臟保存效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，下一步將進(jìn)行NMP灌注后的肝移植實(shí)驗(yàn)以探究移植后肝臟的生理病理變化，進(jìn)一步驗(yàn)證該常溫灌注設(shè)備對(duì)熱缺血損傷肝臟的保護(hù)作用，為將來在臨床的推廣提供了重要的基礎(chǔ)研究意義，為未來的臨床應(yīng)用提供了安全性的證明。