細(xì)胞膜包被納米粒的合成及應(yīng)用研究進(jìn)展

馮毅，馮華國(guó)，張玲，代國(guó)華，李斌，魯靈

1 重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院，重慶402260；2 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

目前，納米技術(shù)已經(jīng)在各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的成就尤為突出[1,2]。許多傳統(tǒng)藥物由于藥代動(dòng)力學(xué)差、滲透性低、被機(jī)體快速清除以及有明顯的細(xì)胞毒性等特點(diǎn)，導(dǎo)致這些藥物對(duì)疾病達(dá)不到預(yù)期的治療效果，而納米粒具有尺寸小(1～1 000 nm)、靶向性高以及循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，將納米粒作為藥物的載體，可以將藥物運(yùn)輸至靶器官，再通過(guò)對(duì)藥物的緩釋作用，達(dá)到對(duì)病灶的持久高效治療[2～4]。但是，納米醫(yī)學(xué)發(fā)展至今，也存在一些問(wèn)題，如納米粒存在一定的細(xì)胞毒性，許多納米粒注入體內(nèi)后可能發(fā)生聚集而導(dǎo)致微循環(huán)阻塞。此外，納米粒進(jìn)入機(jī)體后，在機(jī)體酶的作用下會(huì)變得不穩(wěn)定，導(dǎo)致組織相容性差，出現(xiàn)一系列的排斥反應(yīng)和毒性作用，許多納米粒的臨床試驗(yàn)最終均由于毒性作用和不良反應(yīng)宣告失敗，目前在美國(guó)只有很少的納米材料被批準(zhǔn)用于臨床醫(yī)療[5～7]。可見(jiàn)，進(jìn)一步優(yōu)化納米材料的功能，降低免疫排斥反應(yīng)以及毒性作用和不良反應(yīng)是十分必要的[8]。現(xiàn)在，研究者們合成的細(xì)胞膜包被納米粒(M-NPs)成功解決了部分問(wèn)題，通過(guò)分離具有生物活性的細(xì)胞膜，將細(xì)胞膜與納米粒混勻后反復(fù)擠壓，制備M-NPs。M-NPs一方面具有細(xì)胞膜完整的生物功能，增加了M-NPs的組織相容性，減少排斥反應(yīng)，另一方面也具有納米粒的靶向運(yùn)輸功能，達(dá)到對(duì)病變靶向治療[9～11]。目前已經(jīng)成功合成多種M-NPs，現(xiàn)將M-NPs的合成及應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 M-NPs的合成

M-NPs的合成主要分為三個(gè)步驟：提取具有生物活性的細(xì)胞膜，選擇并合成合適的納米粒，用提取的細(xì)胞膜與納米粒合成具有生物活性的M-NPs。

1.1 細(xì)胞膜的提取 目前用于合成M-NPs的細(xì)胞膜主要有腫瘤細(xì)胞膜、血小板膜、紅細(xì)胞膜、白細(xì)胞膜、間充質(zhì)干細(xì)胞膜、巨噬細(xì)胞膜等。不同細(xì)胞膜的提取方式大致相同，將原代細(xì)胞或細(xì)胞株在低滲溶液中使細(xì)胞腫脹，在超聲中將細(xì)胞震碎，再通過(guò)梯度離心的方式分離細(xì)胞膜[12]。由于細(xì)胞膜除了外膜還有核膜(血小板和紅細(xì)胞除外)，因此，可以通過(guò)細(xì)胞外膜以及核膜的特定標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)，以判斷細(xì)胞膜的提取是否成功。以巨噬細(xì)胞膜的提取為例，F(xiàn)4/80、Toll樣受體-4(TLR4)、CD206以及CD11c等均是巨噬細(xì)胞膜標(biāo)記物，而laminA/C以及受體相互作用蛋白140(RIP140)等均是細(xì)胞核的標(biāo)記蛋白，通過(guò)檢測(cè)提取膜上相應(yīng)標(biāo)記物的表達(dá)，可以判斷提取巨噬細(xì)胞膜的純度[12]。

1.2 納米粒的合成及選擇 目前最常用的納米粒載體是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)微球，此外還有磁性納米載體等。PLGA微球具有良好的生物相容性、長(zhǎng)期使用在體內(nèi)無(wú)儲(chǔ)積、在循環(huán)血液中滯留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)等特點(diǎn)，且PLGA微球的制備方法較為成熟[12]。值得注意的是，制備好的PLGA微球需在透射電鏡下觀察微球直徑和形態(tài)是否均一，用于制備M-NPs的PLGA微球形態(tài)應(yīng)規(guī)整且直徑控制在150 nm以內(nèi)[13,14]。

1.3 M-NPs的制備與鑒定 將提取的細(xì)胞膜以及合成的PLGA微球按照質(zhì)量比1∶1或1∶2混勻，通過(guò)超聲儀處理或者脂質(zhì)體擠出器的反復(fù)擠壓將細(xì)胞膜包被在PLGA微球上[12]，即可合成為M-NPs。合成后的M-NPs需要在電鏡下直觀觀察膜的包被情況，還需要檢測(cè)M-NPs膜上相關(guān)標(biāo)記蛋白的含量及生物功能，從而判斷M-NPs是否合成成功以及是否有生物功能[12]。

2 M-NPs的應(yīng)用

由于M-NPs具備良好的生物相容性以及靶向性等特點(diǎn)，M-NPs近年來(lái)得到了廣泛的研究。目前研究最多的有腫瘤細(xì)胞膜包被的納米粒、血小板膜包被的納米粒、紅細(xì)胞膜包被的納米粒以及白細(xì)胞膜包被的納米粒等，不同細(xì)胞膜包被的納米粒展現(xiàn)了不同的生物學(xué)功能。

2.1 腫瘤細(xì)胞膜包被納米粒的應(yīng)用 腫瘤細(xì)胞是由正常的細(xì)胞在病理刺激下慢慢演變而成，因而宿主的免疫系統(tǒng)無(wú)法識(shí)別腫瘤細(xì)胞；許多抗腫瘤藥物由于組織相容性差以及靶向性差等原因，導(dǎo)致這些抗腫瘤藥物難以發(fā)揮最大的抗腫瘤作用。M-NPs的研究為抗腫瘤提供了新思路。研究[15,16]發(fā)現(xiàn)，用腫瘤細(xì)胞膜包被載藥的納米粒，可以有效避免機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除作用，并增強(qiáng)納米粒對(duì)靶細(xì)胞或靶器官的識(shí)別能力。Xie等[15]通過(guò)設(shè)計(jì)含有葡萄糖氧化酶(GOx)的介孔二氧化硅納米顆粒(MSN)，再用腫瘤細(xì)胞膜對(duì)MSN進(jìn)行包裹，設(shè)計(jì)出的新型仿生納米粒CMSN-GOx不僅能夠逃逸宿主免疫系統(tǒng)，也提高了對(duì)腫瘤組織的靶向性和富集能力，可以抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，并且CMSN-GOx聯(lián)合PD1的治療療效比單獨(dú)使用CMSN-GOx或PD-1具有更好的抗腫瘤效果。Jiang等[17]通過(guò)將紅細(xì)胞(RBC)膜與MCF-7人乳腺癌細(xì)胞膜混合后包被在黑色素納米粒(Melanin)上合成混合細(xì)胞膜包被的納米粒Melanin@RBC-M,其中，MCF-7膜成分顯著增強(qiáng)了Melanin@RBC-M的同源靶向功能，而RBC膜成分有效降低了巨噬細(xì)胞對(duì)Melanin@RBC-M的細(xì)胞攝取，進(jìn)而延長(zhǎng)了Melanin@RBC-M在血液中的循環(huán)時(shí)間。Chen等[18]將腫瘤細(xì)胞膜包被在吲哚菁綠(ICG)負(fù)載的納米粒上合成腫瘤細(xì)胞膜包被的仿生納米粒ICNPs，使得ICNPs對(duì)氧化石墨烯具有特異性的同源靶向性，在體內(nèi)可顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞作用和腫瘤靶向的聚集。此外，ICNPs還善于偽裝成細(xì)胞，以減少肝臟和腎臟的截?fù)簟Ｍ瑫r(shí)，在近紅外激光照射下，ICNPs表現(xiàn)出高效的光熱效應(yīng)，可以有效根除異種移植瘤。Sun等[19]將乳腺癌4T1細(xì)胞膜包被在已載抗腫瘤藥物紫杉醇的納米粒上合成了新型納米復(fù)合物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，構(gòu)建的新型納米復(fù)合物上含有與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的特異黏附分子如Thomsen-Friedenreich抗原、E-cadherin以及CD326等，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，這種新型納米復(fù)合物可以躲避巨噬細(xì)胞攝取、增加體內(nèi)循環(huán)時(shí)間等。

2.2 血小板膜包被納米粒的應(yīng)用 血小板是從骨髓成熟的巨核細(xì)胞胞漿脫落下來(lái)的小塊胞質(zhì)，在血液中的含量不高，但是對(duì)機(jī)體的止血功能極為重要，當(dāng)機(jī)體發(fā)生創(chuàng)傷后，血小板可迅速黏附于創(chuàng)傷處，通過(guò)激活內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)促進(jìn)凝血，達(dá)到止血的目的[20]。血小板膜包被的納米粒不僅具有對(duì)損傷部位靶向移動(dòng)的功能，還可通過(guò)增加藥物在損傷部位的聚集和延長(zhǎng)藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，顯著增加藥物的療效[21]。Chen等[21]制備了一種由血小板膜包被的介孔硅涂層鉍納米棒(BMSNR)合成的仿生材料，這種仿生材料被稱為BMSNR@PM，可通過(guò)血小板膜偽裝降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用來(lái)增強(qiáng)BMSNR的免疫逃逸。此外，與單純BMSNR相比，血小板膜包被增強(qiáng)了BMSNR對(duì)腫瘤的靶向性，可發(fā)揮更好的放射治療效果。研究[21]顯示，BMSNR@PM通過(guò)光熱療法和體內(nèi)放療的聯(lián)合作用，可有效根除癌細(xì)胞，顯著提高了4T1荷瘤小鼠的存活率，聯(lián)合治療效果優(yōu)于單純光熱療法和體內(nèi)放療。Hu等[22]用人類血小板膜包被在納米顆粒上制備了血小板膜包被的納米粒，與未包被的納米顆粒相比，血小板膜包裹的納米粒減少了巨噬細(xì)胞對(duì)納米粒的吸收，而且還具有類似血小板的特性，比如對(duì)受損的人類和嚙齒類動(dòng)物血管的選擇性黏附和對(duì)黏附血小板病原體的增強(qiáng)黏附。Dehaini等[23]將兩種不同細(xì)胞膜(紅細(xì)胞膜和血小板膜)材料融合在一起，制備出一種新型的生物涂層，由此合成的顆粒被稱為紅細(xì)胞-血小板混合膜包覆納米顆粒，經(jīng)過(guò)各種表征分析，這種新型納米生物涂層具有兩種細(xì)胞的特性，該方法為制備具有不同混合功能的生物相容性的仿生納米顆粒提供了參考。此外，Wang等[24]以殼聚糖寡糖(CS)-PLGA共聚物為原料制備了負(fù)載抗癌藥物蟾毒靈(Bu)的多孔納米粒，隨后用血小板膜包被，合成了PM-CS-pPLGA/Bu納米復(fù)合體，共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，由于血小板膜表面的p-選擇素可與肝癌細(xì)胞h22的CD44受體靶向結(jié)合，在h22荷瘤小鼠體內(nèi)，PM-CS-pPLGA/Bu納米復(fù)合體比未包被的CS-pPLGA/Bu納米粒攝取更多，更易在腫瘤內(nèi)積累。

2.3 紅細(xì)胞膜包被納米粒的應(yīng)用 近年來(lái)，光熱療法(PTT)已成為一種很有前途的非侵入性腫瘤治療方法，然而，在生物體內(nèi)開(kāi)發(fā)無(wú)毒、可降解、光熱效率高的生物材料仍面臨挑戰(zhàn)。Jiang等[25]合成了紅細(xì)胞膜包被黑色素納米顆粒的Melanin@RBC，作為體內(nèi)抗腫瘤PTT的平臺(tái)。包被在黑色素納米顆粒上的紅細(xì)胞膜具有良好的光熱特性，可增強(qiáng)納米顆粒在血液中的有效循環(huán)時(shí)間，有效改善了黑色素納米顆粒在腫瘤部位的聚集。在A549荷瘤小鼠體內(nèi)，經(jīng)808 nm光照射后，Melanin@RBC的PTT活性明顯高于單純注射黑色素納米顆粒的裸鼠，在光聲成像儀的引導(dǎo)下，在靜脈注射后4 h左右，腫瘤處Melanin@RBC大量聚集。紅細(xì)胞膜包被的納米粒在血液中的循環(huán)時(shí)間與紅細(xì)胞膜上的CD47蛋白表達(dá)密切相關(guān)。CD47蛋白是一個(gè)完整的膜蛋白，有五個(gè)跨膜區(qū)域，與一個(gè)類似IgV的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域一起牢牢地嵌入到紅細(xì)胞膜中，有助于紅細(xì)胞膜在循環(huán)血液中存活。Rao等[26]通過(guò)合成仿生紅細(xì)胞膜包被的Fe3O4納米顆粒Fe3O4@RBC NPs，發(fā)現(xiàn)Fe3O4@RBC NPs依靠紅細(xì)胞膜表面的CD47蛋白，可有效逃避免疫系統(tǒng)的清除，使用Fe3O4@RBC NPs不會(huì)在細(xì)胞水平和體液水平上引起免疫應(yīng)答，且Fe3O4@RBC NPs的細(xì)胞毒性顯著低于單純Fe3O4納米粒引起的細(xì)胞毒性。這些發(fā)現(xiàn)是研究新型生物材料的開(kāi)發(fā)、解決材料抵抗機(jī)體免疫和快速清除的重大進(jìn)展。

2.4 白細(xì)胞膜包被納米粒的應(yīng)用 白細(xì)胞是機(jī)體免疫細(xì)胞的統(tǒng)稱，包含單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞等，在維持機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡方面起重要作用。白細(xì)胞膜上具有許多特異的免疫識(shí)別受體，白細(xì)胞膜包被的納米粒在具有這些天然免疫識(shí)別受體的同時(shí)，不會(huì)被其他刺激(如炎癥刺激)激活進(jìn)而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，根據(jù)這個(gè)特性，白細(xì)胞膜包被的納米粒在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面具有重要作用。Zhang等[27]將中性粒細(xì)胞膜融合到聚合物核上，制備成一種中性粒細(xì)胞膜包被的納米粒，它能夠中和促炎因子如IL-1β、TNF-α，靶向到達(dá)軟骨基質(zhì)深處，抑制滑膜炎癥，對(duì)損傷關(guān)節(jié)具有較強(qiáng)的軟骨保護(hù)作用。在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型和人類轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，中性粒細(xì)胞膜包被納米粒通過(guò)改善關(guān)節(jié)損傷和抑制關(guān)節(jié)炎顯示出顯著的治療效果。此外，中性粒細(xì)胞膜包被納米粒也有協(xié)助治療胰腺癌的作用。Cao等[28]通過(guò)合成中性粒細(xì)胞膜包被聚乙二醇甲基醚塊聚乳酸-糖基乙酸(PEG-PLGA)納米粒，得到的新型納米顆粒可以克服血胰屏障，實(shí)現(xiàn)胰腺特異性藥物的體內(nèi)傳遞，在荷瘤小鼠異種移植模型中，與沒(méi)有中性粒細(xì)胞膜涂層的納米顆粒相比，有中性粒細(xì)胞膜涂層的納米粒在全身給藥后在腫瘤部位出現(xiàn)了選擇性地聚集。Thamphiwatana等[29]報(bào)道了巨噬細(xì)胞膜包被納米粒MΦ-NPs治療膿毒癥的研究進(jìn)展，MΦ-NPs具有與源細(xì)胞相同的抗原外表，在小鼠大腸桿菌菌血癥模型中, MΦ-NPs 體現(xiàn)出較強(qiáng)的治療效果，其分子機(jī)制與MΦ-NPs通過(guò)中和內(nèi)毒素、抑制炎癥通路的激活、抑制促炎細(xì)胞因子的釋放密切相關(guān)。

2.5 其他細(xì)胞膜包被納米粒的應(yīng)用 目前用細(xì)胞膜包被納米粒的研究較多，除了腫瘤細(xì)胞膜、血小板膜、紅細(xì)胞膜、白細(xì)胞膜以外，還有將自然殺傷細(xì)胞(NK)膜、T細(xì)胞膜以及細(xì)菌膜包被在納米粒上進(jìn)行研究。Deng等[30]用NK細(xì)胞膜包被在納米粒上制備成NK-NPs，得到的NK-NPs能夠靶向腫瘤部位，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呈M1型極化，進(jìn)而產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用，且載于NK-NPs中的光敏劑TCPP可通過(guò)光動(dòng)力治療誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，從而提高抗腫瘤免疫效率。Wei等[31]通過(guò)收集CD4+的T細(xì)胞膜，并將其包被在聚合物核上，由此合成的T細(xì)胞膜包被納米顆粒TNPs，繼承了對(duì)HIV結(jié)合至關(guān)重要的T細(xì)胞表面抗原，如CD4受體、CCR5或CXCR4共受體等。Gao等[32]報(bào)告了一種獨(dú)特的細(xì)菌膜包被納米顆粒作為一種新的抗菌疫苗。Gao等以大腸桿菌為模型病原體，收集細(xì)菌外膜小泡OMVs，并成功地將其包被在直徑為30 nm的小金納米粒上，合成的細(xì)菌膜包被小金納米粒BM-AuNPs在生物緩沖溶液中表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，當(dāng)皮下注射時(shí)，BM-AuNPs可誘導(dǎo)小鼠淋巴結(jié)樹突狀細(xì)胞的快速活化和成熟。此外，接種BM-AuNPs疫苗產(chǎn)生的抗體反應(yīng)比僅接種OMVs疫苗產(chǎn)生的抗體反應(yīng)更持久、更強(qiáng)烈。這些結(jié)果表明，利用天然細(xì)菌膜包被納米粒設(shè)計(jì)的抗菌疫苗具有很大的前景。

綜上所述，M-NPs由于具有源細(xì)胞所表現(xiàn)出的自然特性而受到越來(lái)越多的關(guān)注。各種細(xì)胞膜涂層，包括從紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌中提取的膜，已經(jīng)被廣泛用來(lái)制造具有細(xì)胞功能特性的膜涂層。然而，自2011年Hu等首次發(fā)現(xiàn)M-NPs以來(lái)，相關(guān)領(lǐng)域的研究雖然已經(jīng)取得很大的進(jìn)展，但該領(lǐng)域的研究仍處于起步階段，在這些M-NPs從實(shí)驗(yàn)階段過(guò)渡到臨床階段之前，還需要克服一系列挑戰(zhàn)，包括M-NPs制造過(guò)程的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性問(wèn)題、不同類型膜包被納米粒療效的異質(zhì)性以及這些物理和化學(xué)融合的細(xì)胞膜在材料表面穩(wěn)定性的問(wèn)題等。總之，M-NPs在提供新興的治療和診斷模式方面具有巨大的潛力，必將推動(dòng)納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展。