體細(xì)胞重編程為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的方法研究進(jìn)展

張亞男，翁曉濱，王躍嗣,

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺(tái)264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(MNs)是神經(jīng)元的一種，它能將軸突投射到肌肉，控制機(jī)體的隨意動(dòng)作。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(MNDs)是一類以脊髓和運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的MNs選擇性缺失為特征的異質(zhì)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括脊髓性肌萎縮癥(SMA)和肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)[1],目前在世界范圍內(nèi)尚無有效的治療方法。細(xì)胞替代療法是指將干細(xì)胞移植到病灶來治療各種疾病。將MNs細(xì)胞移植于腦或脊髓的病變部位，修復(fù)損傷細(xì)胞，重塑神經(jīng)組織環(huán)境，有望從根本上治愈MNDs，但MNs細(xì)胞獲取困難。MNs細(xì)胞可由多種體細(xì)胞重編程而來。體細(xì)胞重編程為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的方法是近年的研究熱點(diǎn)，目前有兩種，一種是體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)或神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)再分化為MNs細(xì)胞，一種是體細(xì)胞直接重編程為MNs細(xì)胞。現(xiàn)將相關(guān)研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)再分化為MNs細(xì)胞

2006年，Takahashi等[2]通過病毒載體將四種多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc轉(zhuǎn)入小鼠胚胎或成人成纖維細(xì)胞制成胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，即iPSCs。iPSCs能夠分化成任何類型的細(xì)胞，來源于患者，無胚胎干細(xì)胞(ESCs)所面臨的破壞胚胎的倫理問題。目前，許多研究者開始探討利用多種體細(xì)胞重編程為iPSCs，再分化得到MNs細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞移植藥物研究。

1.1 成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs再分化為MNs細(xì)胞 成纖維細(xì)胞取材較方便，增殖能力強(qiáng)，生長迅速，體外培養(yǎng)后細(xì)胞特性極為穩(wěn)定，因此，成纖維細(xì)胞作為常規(guī)體細(xì)胞來進(jìn)行重編程基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)，已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。Park等[3]通過感染含有4個(gè)多功能基因(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的逆轉(zhuǎn)錄病毒，重編程小鼠尾尖成纖維細(xì)胞為iPSCs，再用小分子維甲酸(RA)和音猬因子(Shh)分化形成MNs細(xì)胞，證實(shí)野生型和ALS小鼠來源的iPSCs在分化成MNs細(xì)胞上沒有明顯差異，ALS相關(guān)iPSCs分化的MNs細(xì)胞可再現(xiàn)ALS的病理特征；與野生型MNs細(xì)胞相比，ALS模型MNs細(xì)胞表現(xiàn)為超氧化物歧化酶SOD1聚集，細(xì)胞存活率降低，神經(jīng)元突起長度縮短，這一研究對(duì)于闡明ALS病理機(jī)制具有重要意義。Liu等[4]利用含有多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf-4和c-Myc的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染SMA患者來源的成纖維細(xì)胞和對(duì)照組成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPSCs，再將SMA來源的iPSCs分化為MNs細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SMA來源的MNs細(xì)胞表現(xiàn)出高興奮性、膜輸入電阻增加、閾值超極化、動(dòng)作電位振幅更大，研究結(jié)果顯示，SMA患者來源的MNs細(xì)胞減少會(huì)導(dǎo)致MNs細(xì)胞的高度興奮性，影響神經(jīng)之間信號(hào)傳遞，從而導(dǎo)致SMA早期的嚴(yán)重癥狀。Dimos等[5]從患有ALS家族性疾病的82歲女性患者身上采集皮膚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染包含Klf4、Sox2、Oct4、c-Myc的逆轉(zhuǎn)錄病毒重編程為iPSCs，這些iPSCs具有胚胎干細(xì)胞的特性，并且利用小分子RA和Shh可定向分化為MNs細(xì)胞。由ALS患者來源的iPSCs攜帶與該患者病理相關(guān)的精確信息，分化的MNs細(xì)胞顯示的與其它細(xì)胞類型之間的關(guān)系以及對(duì)外界環(huán)境的敏感性，這些信息被認(rèn)為在ALS的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

1.2 外周血細(xì)胞重編程為iPSCs再分化為MNs細(xì)胞 靜脈來源的血細(xì)胞，因其易收集且無需在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行耗時(shí)的培養(yǎng)，而優(yōu)于成纖維細(xì)胞。Bossolasco等[6]從攜帶TARDBP p.A382T突變的ALS患者和健康供體的血液中提取外周血單核細(xì)胞，轉(zhuǎn)染包含Klf4、Oct4、Sox2和c-Myc的病毒，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上重編程為iPSCs，再加多個(gè)小分子進(jìn)行分化后得到MNs細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)首次證明，利用外周血細(xì)胞進(jìn)行重編程和分化，可以成功地獲得人類TARDBP突變的MNs細(xì)胞，攜帶TARDBP突變的ALS患者來源的iPSCs具有與對(duì)照組類似的MNs細(xì)胞分化能力，而血細(xì)胞為MNs細(xì)胞的獲得提供了一個(gè)新的來源。血細(xì)胞來源的iPSCs為評(píng)估特定細(xì)胞類型對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供了一個(gè)新的模型系統(tǒng)。

1.3 尿液細(xì)胞重編程為iPSCs再分化為MNs細(xì)胞 尿液細(xì)胞是一種取材方便、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)的細(xì)胞，可在體外重編程成尿源性iPSCs。尿源性iPSCs因其安全、無創(chuàng)分離和易于重編程而成為一種有前途的干細(xì)胞來源。Yi等[7]利用多個(gè)小分子CHIR99021、SB431542、PUR、RA、BDNF、GDNF、IGF首次將尿源性iPSCs分化為成熟的MNs細(xì)胞，并比較了尿源性iPSCs和臍血源性iPSCs分化為MNs的能力。MNs特異性標(biāo)記物陽性標(biāo)記率的比較表明，兩者的分化潛能無明顯差異，這表明尿液細(xì)胞同樣具有重編程為iPSCs以及再分化為MNs細(xì)胞的能力。在與肌肉細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，MNs可投射出長軸突并形成神經(jīng)肌肉連接(NMJs)。免疫熒光和PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，尿源性iPSCs分化的MNs細(xì)胞可表達(dá)MNs細(xì)胞特異性標(biāo)志物。迄今為止，包括皮膚成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞在內(nèi)的不同來源的多種體細(xì)胞iPSCs已被用于重編程為iPSCs以及MNs細(xì)胞的再分化過程中[8]。與皮膚成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞相比，尿源性iPSCs以無創(chuàng)分離的方式容易獲得，因此，為MNDs的疾病建模、藥物篩選和細(xì)胞治療提供了一個(gè)新的平臺(tái)。

2 體細(xì)胞重編程為NSCs再分化為MNs細(xì)胞

NSCs是一群存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，能夠自我更新、增殖，并具有多種分化潛能的細(xì)胞，在適當(dāng)條件下可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。Lee[9]等研究顯示，NSCs分化來源的MNs，對(duì)ALS模型SOD1G93A小鼠進(jìn)行鞘內(nèi)移植，延遲了小鼠的發(fā)病時(shí)間，延長了壽命。該研究結(jié)果表明，鞘內(nèi)移植NSCs來源的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，可替代丟失的MNs細(xì)胞，無明顯不良反應(yīng)，此種治療方式對(duì)ALS患者是有益的，這些NSCs來源的MNs細(xì)胞可作為ALS患者細(xì)胞治療的來源。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細(xì)胞，通過血管周足和突起連接毛細(xì)血管與神經(jīng)元，對(duì)神經(jīng)元可以起到運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和排除代謝產(chǎn)物的作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過患者大腦皮層的活檢輕易獲得，這使得自體移植成為可能。有研究者[10]在體外培養(yǎng)出生后15～20 d的大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，在表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)存在的條件下，誘導(dǎo)出NSCs克隆球，再用胞外誘導(dǎo)信號(hào)分子RA和Shh，誘導(dǎo)干細(xì)胞向MNs細(xì)胞分化，證實(shí)成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞可以重編程為NSCs，并首次證明它們可以分化為97.7%的MNs祖細(xì)胞和至少30%的MNs細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞為脊髓損傷中丟失的MNs細(xì)胞替代療法提供了一個(gè)有價(jià)值的細(xì)胞來源。

3 體細(xì)胞直接重編程為MNs細(xì)胞

直接重編程，是指一種成熟細(xì)胞經(jīng)重編程能夠直接變成另一種類型的成熟細(xì)胞，而不需要經(jīng)過iPSCs或NSCs中間階段。直接重編程的細(xì)胞可能比經(jīng)過iPSCs中間階段產(chǎn)生的細(xì)胞更加安全，且耗時(shí)更短，更加有利于臨床應(yīng)用。

3.1 成纖維細(xì)胞直接重編程為MNs細(xì)胞

3.1.1 利用轉(zhuǎn)錄因子將成纖維細(xì)胞直接重編程為MNs細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因5′端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過程。利用轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行細(xì)胞重編程主要是通過控制細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)，從而確定細(xì)胞的類型。Son等[11]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體，包含七個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、Brn2、Myt1l、Lhx3、Hb9、Isl1和Ngn2，直接將小鼠和人類成纖維細(xì)胞重編程為MNs細(xì)胞，不經(jīng)過iPSCs狀態(tài)。上述研究結(jié)果表明，過表達(dá)篩選的的轉(zhuǎn)錄因子足以將小鼠和人類成纖維細(xì)胞直接誘導(dǎo)成MNs細(xì)胞，且成纖維細(xì)胞直接重編程形成的MNs表現(xiàn)出的形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)特征、電生理學(xué)、突觸功能、體內(nèi)遷移能力和對(duì)退化的敏感性，與胚胎來源的MNs細(xì)胞相似。Zhang等[12]將SMA患者來源的成纖維細(xì)胞和健康者來源成纖維細(xì)胞同時(shí)混合感染8種慢病毒載體，均能有效轉(zhuǎn)化為MNs細(xì)胞，SMA組和對(duì)照組的轉(zhuǎn)換效率分別約為5.8%和5.5%,這些神經(jīng)元在培養(yǎng)過程中活力旺盛，具有神經(jīng)元遷移、突觸生長和神經(jīng)元連接形成的能力。

3.1.2 利用小分子將成纖維細(xì)胞直接重編程為MNs細(xì)胞 小分子誘導(dǎo)細(xì)胞重編程的方法，是利用小分子與細(xì)胞內(nèi)源因子相互作用的原理，可避開基因操作，使得體細(xì)胞可以獲得轉(zhuǎn)化為其它類型的細(xì)胞能力的特性。相比插入外源基因，小分子的優(yōu)勢在于操作簡單、處理時(shí)間易掌握、降低實(shí)驗(yàn)成本，且可以人為調(diào)整濃度與組合。Qin等[13]利用五個(gè)小分子Kenpaullone、Forskolin、Y-27632、Purmorphamine、Retinoic acid直接將人類和小鼠成纖維細(xì)胞重編程為適合細(xì)胞替代治療和神經(jīng)退行性疾病建模的MNs細(xì)胞。與重編程為iPSCs再分化為MNs細(xì)胞費(fèi)時(shí)、復(fù)雜的過程相比，誘導(dǎo)MNs細(xì)胞的速度快(3～5天)、簡單、高效(>90%)。AG1-X2樹脂微球用含有小分子Kenpaullone、Forskolin、Y-27632、Purmorphamine、Retinoic acid的培養(yǎng)液浸泡過后，和對(duì)照組分別植入小鼠背部皮膚，兩天后對(duì)背部皮膚樣本染色分析發(fā)現(xiàn)，小鼠背部皮膚細(xì)胞開始表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)記物，表明在體內(nèi)也可以直接進(jìn)行MNs的直接重編程。

3.1.3 利用miRNA和轉(zhuǎn)錄因子將成纖維細(xì)胞直接重編程為MNs細(xì)胞 miRNA最早是1993年在線蟲中被發(fā)現(xiàn)[14]，它是一種非編碼RNA(長度20～25 bp)。miRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用為基因表達(dá)調(diào)控提供了一種新的策略，并影響一系列細(xì)胞事件。既往研究[15]表明，miRNA參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育及凋亡等復(fù)雜的生物進(jìn)程，對(duì)細(xì)胞具有重要的調(diào)控和生理功能。miRNA表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，不整合進(jìn)基因組，利用miRNA進(jìn)行細(xì)胞重編程避免了外源基因的插入和多種小分子產(chǎn)生的毒性，具有非常高的安全性。Abernathy等[16]利用攜帶有miRNA-9/9*和miRNA124的慢病毒，轉(zhuǎn)染22～68歲的成人成纖維細(xì)胞，并添加Dox、Valproic acid、Dibutyryl cAMP、Retinoic Acid、Dox進(jìn)行重編程，直接將成纖維細(xì)胞重編程為MNs。研究表明，miRNA可介導(dǎo)成纖維細(xì)胞直接重編程為MNs，單獨(dú)的ISL1和LHX3不足以重編程為MNs細(xì)胞，揭示了miRNA與轉(zhuǎn)錄因子之間的模塊存在協(xié)同作用，從而實(shí)現(xiàn)特定譜系的神經(jīng)元重編程。這項(xiàng)研究成果為從患者身上產(chǎn)生不同亞型的人類神經(jīng)元提供了一個(gè)選擇。

3.1.4 利用轉(zhuǎn)錄因子和小分子將成纖維細(xì)胞直接重編程為MNs細(xì)胞 Liu等[17]利用攜帶有NEUROG2-IRES-GFP-T2A-SOX11和ISL1-T2A-LHX3(NSIL)的慢病毒，轉(zhuǎn)染健康的成年人和ALS患者來源的皮膚成纖維細(xì)胞，并用小分子Forskolin、Dorsomorphin和FGF2進(jìn)行重編程，結(jié)果表明，成人成纖維細(xì)胞可以被有效地直接重編程為高純度的MNs，且這些神經(jīng)元表現(xiàn)出成熟的電生理學(xué)特性，形成神經(jīng)肌肉連接，并控制肌肉活動(dòng)，而從ALS患者來源的成纖維細(xì)胞重編程的MNs細(xì)胞表現(xiàn)出相應(yīng)的生理缺陷，可以通過加入一種小分子化合物Ken來糾正。Tang等[18]使用包含NGN2-IRES-GFP-T2A-mSOX11和ISL1-T2A-LHX3的兩種慢病毒做載體，并用小分子Forskolin、Dorsomorphin、bFGF進(jìn)行誘導(dǎo)，可以直接將成纖維細(xì)胞重編程為MNs。由于衰老是神經(jīng)退行性病變發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，在發(fā)病年齡使用MNs細(xì)胞來概括年齡相關(guān)特征是很重要的。Tang等[18]比較了iPSCs的重編程和原代成纖維細(xì)胞的直接重編程兩種方法獲得的MNs細(xì)胞，雖然iPSCs的產(chǎn)生必須經(jīng)過表觀遺傳過程，進(jìn)入多能態(tài)，但直接轉(zhuǎn)化的MNs具有保留成纖維細(xì)胞供體衰老相關(guān)特征的優(yōu)勢。iPSCs可以重置來自于其供體的衰老狀態(tài)，如端粒磨損和細(xì)胞衰老。直接重新編程的MNs細(xì)胞，保留供體成纖維細(xì)胞的老化特征,包括廣泛的DNA損傷、異染色質(zhì)和核組織的損失，并增加SA-β-Gal活動(dòng)，這表明成纖維細(xì)胞來源的MNs細(xì)胞可能更適合研究遲發(fā)型MNDs的發(fā)病機(jī)制。

3.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為MNs細(xì)胞 秦華[19]從ALS模型小鼠脊髓中提取出星形膠質(zhì)細(xì)胞，用小分子的組合Kenpaullone、Y-27632、Forskolin、Purmorphamine、Retinoic acid(簡寫為KFYPR)進(jìn)行誘導(dǎo)，可在1～2天內(nèi)快速誘導(dǎo)將扁平的星形膠質(zhì)細(xì)胞變成單極、雙極或多極的神經(jīng)元形態(tài)，細(xì)胞體積變小，突起增多，胞體折光性增強(qiáng)。通過免疫熒光染色顯示沒有神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，證實(shí)沒有經(jīng)歷干細(xì)胞中間狀態(tài)。誘導(dǎo)的MNs可作為MNDs模型，用于揭示MNDs的病因、發(fā)展機(jī)制，也可用于開發(fā)、篩選和評(píng)估治療的藥物。星形膠質(zhì)細(xì)胞存在于脊髓組織中，如果在脊髓中輸入小分子，直接將星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為MNs，則有望實(shí)現(xiàn)MNs的體內(nèi)再生。

綜上所述，我們介紹了不同體細(xì)胞重編程為MNs細(xì)胞的兩種方法：通過重編程獲得iPSCs或NSCs再分化為MNs細(xì)胞的過程繁瑣，耗時(shí)長、效率低，有面臨基因突變的風(fēng)險(xiǎn)；而直接重編程，方法簡便、且耗時(shí)更短，更有利于臨床。但目前，仍存在一些問題需要探討，一是體細(xì)胞重編程大多采用病毒轉(zhuǎn)染的方法，而病毒載體的使用，存在病毒基因整合到初始細(xì)胞的基因組并導(dǎo)致細(xì)胞基因發(fā)生變異的可能性，因此，尋找合適的轉(zhuǎn)染方法對(duì)于重編程的MNs能否應(yīng)用于臨床起著關(guān)鍵作用。二是利用小分子化合物替代重編程因子中的部分轉(zhuǎn)錄因子來提高重編程效率，也能減少對(duì)使用病毒載體的依賴，但是小分子在重編程過程中的作用機(jī)制尚不清楚。隨著重編程技術(shù)的不斷優(yōu)化和發(fā)展，相信在不久的將來,人們將在重編程的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用領(lǐng)域取得更為重要的突破。