血清miR-10a、IL-35水平對膿毒癥并發急性腎損傷的診斷效能

劉巖，任思思，馬秋晟，徐麗娜

天津市北辰醫院，天津300400

膿毒癥是感染誘發的全身炎癥反應綜合征，炎癥反應失控可造成多器官功能障礙綜合征，影響患者的臨床預后。相關研究[1，2]報道顯示，全球目前大約有1800萬例膿毒癥患者，且發病率呈不斷上升趨勢。膿毒癥有較高的發病率和死亡率，是引起急性腎損傷(AKI)的最常見病因。研究[3～5]顯示，在膿毒癥患者中，AKI的發生率為40%～50%，且膿毒癥患者發生AKI后住院死亡率可增加6～8倍，遠期慢性腎臟病和心血管死亡風險也相應增加。目前膿毒癥并發AKI尚缺乏有效的治療手段，因此，尋找早期診斷膿毒癥并發AKI的血清學指標，有助于臨床早期干預并改善預后。目前臨床常用于評估膿毒癥并發AKI的血清標志物主要包括血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白、尿腎損傷分子-1和血半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，但診斷的準確性不高，臨床應用價值受限[6]。miRNA能夠在轉錄后水平上對基因的表達進行調控，介導腎臟功能的調節過程。既往研究[7]報道，miR-10a過表達對于膿毒癥并發AKI具有腎臟保護作用。研究[8]發現，白細胞介素-35(IL-35)可能參與機體免疫應答反應,可調節炎性反應過程，與膿毒癥患者的發生發展有關。本研究觀察了血清miR-10a、IL-35水平對膿毒癥并發AKI的診斷效能，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1月～2019年1月天津市北辰醫院收治的膿毒癥患者100例，根據是否并發AKI，分為AKI組和非AKI組。AKI組患者43例，男26例、女17例，年齡(53.72±12.53)歲；非AKI組患者57例，男30例、女27例，年齡(51.86±11.91)歲，兩組患者性別、年齡等資料具有可比性。納入標準：①膿毒癥的診斷根據2012年國際嚴重膿毒癥及膿毒性休克診療指南[9]標準；②AKI的診斷依據2012年改善全球腎臟病預后組織(KDIGO)臨床實踐指南[10]標準：與基線血肌酐比較，48 h內血肌酐升高≥26.5 μmol/L或7 d內血肌酐升高≥基線值的1.5倍定義為AKI；③膿毒癥并發AKI的診斷標準為同時滿足膿毒癥和AKI的診斷標準；④患者自愿參與并簽署知情同意書。排除標準：①患者入院時已進入慢性腎臟病五期或長期行腎臟替代治療；②由膿毒癥以外其他病因導致的AKI，包括腎小球腎炎、腎血管性疾病、腎小球壞死、泌尿系統梗阻、應用腎毒性藥物等；③截肢術后患者；④腎移植術后患者。依據AKI分級標準將AKI組43例膿毒癥并發AKI患者分為Ⅰ級組(23例)、Ⅱ級組(14例)、Ⅲ級組(6例)。Ⅰ級：48 h內血肌酐升高≥26.5 μmol/L或7 d內血肌酐升高為基線值的1.5～1.9倍；Ⅱ級：7 d內血肌酐升高為基線值的2.0～2.9倍；Ⅲ級7 d內血肌酐升高≥基線值的3.0倍或血肌酐≥353.6 μmol/L或開始腎臟替代治療。

1.2 各組患者血清miR-10a檢測 采用PT-PCR法。清晨空腹狀態時采集患者肘部靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，將獲取的血清保存于-80 ℃冰箱中備用。采用RNA提取純化試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以U6為內參進行PCR反應。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。miR-10a上游引物為5′-GGAGGGGTACCA-GAATCCCATTTTGGCCA-3′，下游引物為5′GGAGGAAGCTTGCGGAGTGTTTATGTCAACT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以2-ΔΔCt表示血清中miR-10a的相對表達量。

1.3 各組患者血清IL-35檢測 采用ELISA法。取離心后的血清，采用ELISA法檢測血清IL-35水平，檢測流程依據ELISA試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 各組患者血清miR-10a相對表達量、IL-35水平比較 AKI組患者血清miR-10a相對表達量、IL-35水平分別為3.34±0.53、(501.74±36.79)pg/mL，非AKI組患者血清miR-10a相對表達量、IL-35水平分別為1.09±0.32、(269.47±28.79)pg/mL，兩組相比，P均<0.001。Ⅰ級組患者血清miR-10a相對表達量、IL-35水平分別為2.98±1.06、(438.84±26.89)pg/mL，Ⅱ級組患者血清miR-10a相對表達量、IL-35水平分別為4.31±1.82、(521.94±32.69)pg/mL，Ⅲ級組患者血清miR-10a相對表達量、IL-35水平分別為5.89±1.98、(598.54±26.79)pg/mL，組間相比，P均<0.001。

2.2 血清miR-10a、IL-35水平對膿毒癥并發急性腎損傷的診斷效能 血清miR-10a水平診斷膿毒癥并發AKI的曲線下面積為0.765(95%CI為0.698～0.813)，取截斷值為3.23時，血清miR-10a水平診斷膿毒癥并發AKI的敏感度為79.34%、特異度為81.23%；血清IL-35水平診斷膿毒癥并發AKI的曲線下面積為0.801(95%CI為0.765～0.892)，取截斷值為398.74 pg/mL時，血清IL-35水平診斷膿毒癥并發AKI的敏感度為78.65%、特異度為82.46%；血清miR-10a聯合IL-35水平診斷膿毒癥并發AKI的曲線下面積為0.875，取血清miR-10a水平的截斷值為3.23、血清IL-35水平的截斷值為398.74 pg/mL時，診斷膿毒癥并發AKI的敏感度為83.56%、特異度為88.21%。

3 討論

膿毒癥是危重癥患者常見的臨床綜合征，病死率高，臨床預后較差。研究[11]顯示，膿毒癥危重癥患者病死率約為45.2%，而膿毒癥并發AKI后病死率可增加至74.5%。研究[12]表明，膿毒癥并發AKI的患者臨床并發癥遠遠多于單純膿毒癥未并發AKI的患者以及非膿毒癥AKI患者。膿毒癥患者由于炎癥誘發細胞缺氧和氧化應激，進一步引起腎臟血流動力學變化，腎臟血流灌注不足，細胞因子和趨化因子介導腎小管細胞損傷和凋亡，最終導致腎臟損傷并誘發AKI的發生[13]。目前膿毒癥并發AKI早期診斷困難，尋找早期診斷膿毒癥并發AKI的生物標志物顯得尤為重要。

miRNA是一類長度約為22個核苷酸的由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，參與轉錄后基因表達調控。在腎臟調控和介導損傷的過程中，腎臟可通過調控miRNA的表達，進一步導致調節關鍵通路的信號蛋白的高表達或低表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程，介導腎臟損傷[14]。近年來，不少研究[7]證實，miRNA在評估膿毒癥并發AKI的臨床預后方面具有重要作用。既往研究[15]表明，miR-10a是調控免疫應答水平的關鍵因子之一，在炎癥性腸病、風濕免疫性疾病、腫瘤等領域得到深入廣泛的研究，而在膿毒癥并發AKI患者中尚未得到深入的認識。炎癥是引起膿毒癥的病因，而白細胞介素作為趨化因子家族的一種細胞因子，在介導炎癥損傷和免疫應答等方面發揮重要的作用。有研究[16]表明，在膿毒癥并發AKI的患者中，IL-35通過抑制Teff和Th17等的免疫活性，在免疫調控網絡中發揮負向調節作用，抑制相應的免疫應答。此外，L-35還可以通過上調IL-10分泌及調節型T細胞比例，抑制IL-2與IFN-γ生成，抑制過度激活的免疫調節系統[17]。本研究結果顯示，血清miR-10a和IL-35在膿毒癥并發AKI的患者中表達上升，且AKI分級越高，miR-10a和IL-35的表達水平越高，由此提示，miR-10a和IL-35表達上調可能介導膿毒癥患者的腎臟損傷，且miR-10a和IL-35的水平與膿毒癥并發AKI的嚴重程度相關。由于miR-10a和IL-35參與膿毒癥患者的炎癥反應和免疫應答，而當炎癥誘發腎臟損傷時，可通過基因調控以及介導炎癥的細胞因子的表達，參與炎癥損傷過程，進而導致miR-10a和IL-35的表達升高[18]。IL-35作為一種新發現的、具有強力免疫抑制效應的細胞因子，與多種疾病包括感染性疾病、膿毒癥、自身免疫性疾病、炎癥及腫瘤等密切相關[8]，膿毒癥患者由于較強的免疫炎癥反應，需要上調IL-35水平以抑制相應的免疫應答。而miR-10a上調能夠提高TNF-γ及IL-2等炎癥因子的表達，調節免疫應答和介導腎臟損傷。因此，miR-10a和L-35可能可以作為膿毒癥并發AKI治療和干預的新靶點。

此外，本研究通過ROC分析還發現，血清miR-10a聯合IL-35水平診斷膿毒癥并發AKI的曲線下面積高于miR-10a和IL-35單獨診斷膿毒癥并發AKI的曲線下面積，特異性高達88.21%，敏感性高達83.56%。由此可見，血清miR-10a和IL-35水平在膿毒癥并發AKI的診斷方面具有較高的臨床應用價值。由于膿毒癥并發AKI本身是炎癥介導的腎臟損傷過程，而miR-10a和IL-35參與炎癥損傷過程，因此，血清miR-10a聯合IL-35對于早期診斷膿毒癥并發AKI以及評估疾病的嚴重程度具有重要的作用。

綜上所述，膿毒血癥并發AKI患者血清miR-10a相對表達量、IL-35水平升高，與AKI分級有關；檢測血清miR-10a、IL-35有助于膿毒癥并發AKI的診斷和疾病嚴重程度的評估。miR-10a和IL-35可以作為膿毒癥并發AKI早期診斷和評估嚴重程度的血清標志物，有可能成為膿毒癥并發AKI治療的新靶點。