活血止痛方調控Wnt/β-catenin信號通路對膝骨性關節炎的影響

邵榮學 周輝 潘浩 樂軍 陳寶英

骨關節炎（OA）是以關節及周圍滑膜的增生、肥厚，軟骨的降解、破壞，軟骨下骨的囊性變、繼之硬化，邊緣性骨贅形成等為病理改變，以關節腫痛、僵硬、活動受限為臨床表現的一種常見疾?。?］。其中以膝骨關節炎（KOA）最為常見，而KOA的發病機制目前尚未明確。有研究表明，活血止痛方能夠有效緩解膝骨性關節炎患者的關節腫脹、疼痛等癥狀，促進關節功能恢復［2］。但其作用機制尚未明確，有研究證實Wnt/β-catenin信號通路通過調控關節軟骨發育、骨化、重塑、骨折修復等，參與KOA的發生與發展［3-7］。2018年6月至2019年3月作者通過建立KOA大鼠模型，探討活血止痛方保護關節軟骨的作用機制，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，6個月齡，體重280～310g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。按照隨機數字表法，將大鼠分為中藥組、模型組和對照組，每組12只，用體積分數4%的水合氯醛（1ml/l00g）腹腔注射麻醉，中藥組和模型組采用改良Hulth法［8］復制KOA模型；對照組切開膝關節處皮膚、打開關節腔，不切斷內側副韌帶及前交叉韌帶，不摘除內側半月板。術后連續3d，每天用碘伏消毒所有大鼠手術切口、且予以2萬U青霉素肌肉注射預防感染早晚各1次。術后第4天開始，強迫大鼠跑步0.5h/d，連續4周。

1.2 藥物制備及干預 術后第5周開始中藥組灌服活血止痛方湯藥進行治療，灌服量為2ml/（次·d），模型組和對照組灌服等量的生理鹽水，1次/d，直到取材。其中活血止痛方（赤芍藥12g，紅花3g，川穹10g，當歸12g，三七6g，紫金藤15g，蘇木10g，積雪草6g，地鱉蟲10g，陳皮10g，丹參10g，乳香10g），其提取物按照人與大鼠體表面積折算，含生藥量0.8377g/ml（由杭州市中醫院制劑室提供）。

1.3 實驗儀器 光學顯微鏡（OLYMPUS，Japan）；電子天平（Startorius，德國）；自動雙重純水蒸餾器（SZ-93，上海亞榮生化儀器廠）；超凈工作臺（SW-CJ-1FD型，蘇州凈化設備有限公司）；冰凍切片機（AO，美國）等。

1.4 觀察指標（1）大體觀察：術后第8、12周，每組隨機取6只大鼠。乙醚誘導麻醉，斷頸法處死大鼠，解剖膝關節。肉眼觀察膝關節軟骨表面及關節邊緣改變、滑膜炎性改變。KOA的判斷方法：肉眼大體觀察，根據文獻報道的評分標準［9］，由與本實驗無關的同一組人員，采用盲法評分。見表1。（2）Mankin評分：將上述標本按照文獻報道的評分標準［10］，由與本實驗無關的同一組人員，采用盲法進行半定量評分，計算每個標本的總分。見表2。（3）病理形態學觀察：將上述膝關節標本從股骨遠端及脛骨近端同軟骨下骨切下，按脫鈣操作程序常溫脫鈣6周，更換脫鈣液1次/2周。脫鈣完成后，取內側半脛骨關節面，修成1.5mm×1.5mm×2.5mm的組織塊。冷凍切片機箱內溫度-25℃，片厚10μm下連續切片，室溫晾干，然后行蘇木精/番紅-O/固綠復染。病理切片干燥后，進行倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。（4）軟骨組織β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達：將上述膝關節標本從股骨遠端及脛骨近端同軟骨下骨切下，應用半定量RT-PCR技術檢測不同取材時期各組SD大鼠軟骨組織中β-catenin、基質金屬蛋白酶（MMP）-13、TNF-α基因的表達量，其RT-PCR 引物序列見表3。

表1 關節軟骨病變大體評分標準

表2 Mankin軟骨組織形態學改變評分標準

表3 基因RT-PCR 引物序列表

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察 術后第8周剖開右膝關節：中藥組和對照組見軟骨表面光滑，色澤正常，軟骨大體評分為0分（見圖1A）；模型組見滑膜增生明顯，軟骨失去正常光澤，關節面粗糙，呈磨損性變，軟骨缺損，關節邊緣有骨贅形成，關節軟骨大體評分為1～2分（見圖1B）。術后第12周：中藥組見滑膜輕度充血水腫，軟骨表面色暗紅，失去正常光澤，軟骨表面欠光滑但尚平整，軟骨大體評分為0～1分（見圖1C）；模型組膝關節腫脹變形，關節活動不利，膝關節滑膜呈結節樣增生，軟骨失去正常光澤，關節面粗糙，呈磨損性變，軟骨剝脫，軟骨下骨暴露，關節邊緣有骨贅形成，關節軟骨大體評分為3～4分（見圖1D）；對照組見軟骨表面光整，色澤正常，軟骨大體評分為0分。

圖1 術后8、12周關節情況

2.2 病理形態學觀察 術后第8周：中藥組見滑膜組織細胞呈單層排列，滑膜下毛細血管未見增生，間質無明顯水腫，偶見少量單核、淋巴細胞浸潤（見圖2A）；軟骨形態正常，軟骨細胞各層次排列規則、分布均勻，表面光整，潮線清晰，細胞呈柱狀排列，偶見表層軟骨變薄，呈裂隙樣改變（見圖2B）。模型組見滑膜細胞增生明顯，可見炎性浸潤，主要為淋巴細胞浸潤，部分區域可見單核細胞浸潤以及細胞凋亡，滑膜下層毛細血管增生明顯，可見結締組織增生（見圖2C）；軟骨表面紊亂，失去正常光澤，可見軟骨表層剝脫，呈絨毛狀，其軟骨細胞柱狀排列消失，有細胞簇出現，軟骨下骨未見明顯異常改變（見圖2D）。sham組滑膜組織細胞排列整齊，間質無水腫，滑膜下毛細血管未見增生，無炎性細胞浸潤；軟骨形態正常，軟骨細胞各層次排列規則、分布均勻，表面光整，潮線清晰。術后第12周：中藥組見滑膜輕度增厚，間質輕度水腫，有少量單核、淋巴細胞浸潤，滑膜下層毛細血管輕度增生，偶見纖維化（見圖3A）；關節軟骨結構輕度破壞，軟骨表層染色減少，無明顯破裂或大片失染，偶見潮線中斷、軟骨細胞簇集現象，骨小梁結構基本完整（見圖3B）。模型組見滑膜細胞增生明顯，并可見明顯的炎細胞浸潤，主要為淋巴細胞，滑膜下毛細血管增生，纖維化明顯（見圖3C）；關節軟骨剝脫、粗糙，軟骨細胞凋亡明顯、殘存軟骨細胞排列雜亂，骨小梁的結構紊亂，軟骨下骨增生硬化（見圖3D）。對照組的結果與第8周相似。

圖2 術后8周關節病理

圖3 術后12周關節病理

2.3 軟骨大體評分和Mankin評分 對照組軟骨大體評分和Mankin評分均為“0”分，其他兩組的軟骨大體評分和Mankin評分隨著時間變化而增高，兩個時間點中藥組評分均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組軟骨大體評分、Mankin評分（±s）

表4 各組軟骨大體評分、Mankin評分（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與對照組比較，#P＜0.05

組別 時間（周） n 軟骨大體評分（分） Mankin評分（分）中藥組 8 6 1.00±0.63*# 2.50±1.05*#模型組 8 6 1.83±0.75# 5.33±1.03#對照組 8 6 0 0中藥組 12 6 2.16±0.75*# 6.83±1.47*#模型組 12 6 3.33±0.82# 9.67±1.21#對照組 12 6 0 0

2.4 軟骨組織β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達 不同時間點模型組β-catenin、MMP-13和TNF-α基因mRNA的表達量均高于中藥組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥組β-catenin、MMP-13和TNF-α基因表達量均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 軟骨組織β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達

3 討論

本研究結果顯示，中藥組、模型組和對照組術后不同時間點膝關節軟骨中均檢測到β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達，不同時間點模型組上述基因mRNA的表達量均高于中藥組和對照組；中藥組上述基因表達量均高于對照組。正常膝關節軟骨細胞外基質主要由蛋白多糖和Ⅱ型膠原組成，基質金屬蛋白酶家族由鋅肽鏈內切酶組成，能降解多種細胞外基質蛋白成分包括蛋白多糖和Ⅱ型膠原。其中MMP-13廣泛存在于骨關節炎患者的關節軟骨和滑膜中，其裂解Ⅱ型膠原的作用較強，被認為是裂解Ⅱ型膠原作用最強的酶［11］。TNF-α是關節炎病理改變過程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的最重要細胞因子［12］。其能夠刺激蛋白多糖的消耗和膠原網絡的損傷并減少軟骨基質蛋白的合成，誘導基質金屬蛋白酶（MMPs）、尤其是MMP-13的高表達，促進軟骨基質內膠原的降解，促進關節滑膜皺襞增生、炎癥進展，改變關節軟骨細胞正常結構與功能，促進軟骨細胞凋亡；改變軟骨中膠原成分，造成關節軟骨生存的微環境惡化，促進骨性關節炎加重［13-16］。上述研究與本資料結果一致，β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達參與KOA 的產生和發展。本實驗結果顯示，術后不同時間點中藥組膝關節軟骨中β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表達量均低于模型組，從而證實活血止痛方藥能延緩KOA的進展。

盡管近年來對KOA的研究取得較多成績，但其發生和發展機制仍知之甚少。前期研究證實典型的Wnt/β-catenin信號通路是一個關鍵的信號通路，參與調節KOA發病機制之一。主要病理特征為軟骨基質退化、軟骨下骨改變和軟骨周圍骨贅形成等，最終導致關節僵硬和疼痛。根據本實驗結果推測，活血止痛方能保護或修復膝關節軟骨細胞，重塑細胞的衰老平衡穩態，延緩關節病損，促進病損關節的康復，其機制可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路保護膝關節軟骨有關，其具體機制尚待進一步研究。