柱前衍生FMOC-HPLC 法測定紡織品中膠原蛋白的含量

韓瑩瑩,譚玉靜,趙海浪

（上海市質量監督檢驗技術研究院，上海200040）

0 引言

紡織品是人類生活和生產的必需品，由膠原蛋白纖維制成的紡織面料及服裝，更能體現現代人高品質的健康生活。與一般植物蛋白相比，膠原蛋白更適合通過紡絲生產出蛋白纖維[1]，且其特有的螺旋結構能很好地鎖住水分，給皮膚帶來滋潤和護理的效果。因此，膠原蛋白纖維與人體皮膚接觸時有良好的親和性，也具有較好的穿著舒適性。可以預見，未來膠原蛋白在紡織品上的應用更是今后紡織類用品發展的必然趨勢。然而，由于對膠原蛋白的檢測缺乏相應的方法和標準，導致市場上假冒偽劣產品橫行，嚴重損害消費者的利益。因此，建立紡織品中膠原蛋白含量的檢測方法，對當前相關監管機構、檢測機構和生產企業是一項非常迫切的任務，且對今后功能性紡織品質量的有效監管也具有十分重大的意義。

鑒于羥脯氨酸是膠原蛋白的特異性氨基酸，且含量穩定，因此，本試驗以羥脯氨酸為研究對象，采用柱前衍生高效液相色譜法測定紡織品中膠原蛋白含量，希望研究結果可為功能性紡織品的質量控制提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀，Agilent 1260 型，配有熒光檢測器（FLD），安捷倫科技有限公司；超聲發生器，SK-8210 HP 型，上海科導儀器有限公司；分析天平，TLE204 型，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；電熱鼓風干燥箱，DGX-9423B-1，上海福瑪儀器有限公司。本試驗選用的安捷倫色譜柱為Agilent Poroshell HPH-C18，4.6mm×100mm，2.7μm。

試劑：甲醇、乙腈為色譜純，購于CNW Technol?ogies GmbH（德國CNW）；鹽酸、硫酸、磷酸氫二鈉、硼酸鈉為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水，為成都優普UPH-I-5T 型超純水系統現制備的高純去離子水；羥脯氨酸標準品、鄰苯二甲醛（OPA）試劑、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）試劑、硼酸鹽緩沖液，安捷倫科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量羥脯氨酸標準品，用0.1 mol∕L HCl 溶液超聲溶解，定容于容量瓶，稀釋配制成9、27、45、90、180 pmol∕L 的系列標準溶液（1 pmol∕L=10-12mol∕L）。

1.3 衍生化試劑的制備

FMOC試劑：將1 mL安瓿瓶裝的FMOC分裝成10 份，每份各100 μL，裝入樣品瓶的錐形內插管中，蓋封，4 ℃冷藏。此保存條件下，分裝后的溶液在7～10 d內可保持穩定。

OPA 試劑：將1 mL安瓿瓶裝的OPA分裝成10份，每份各100 μL，裝入樣品瓶的錐形內插管中，蓋封，4 ℃冷藏。此保存條件下，分裝后的溶液在7～10 d內可保持穩定。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell HPH-C18，4.6 mm×100 mm，2.7 μm。

流速：1.5 mL∕min。

柱溫：40 ℃。

流動相：A含10 mmol∕L磷酸氫二鈉、10 mmol∕L硼酸鈉的緩沖溶液，用鹽酸調溶液pH值至8.2；B為甲醇、乙腈、水按45∶45∶10的比例的混合溶液。

梯度洗脫程序：0～0.35 min，B，2%；0.35～13.40 min，B，57%；13.40～15.70 min，B，100%；15.70～18.00 min，B，2%。

檢測波長：激發波長266 nm，發射波長305 nm。按上述色譜條件可得到標準溶液及樣品的色譜峰，詳見圖1和圖2。

1.5 樣品處理

將樣品剪成5 mm×5 mm 的碎片，混勻，稱取1.0 g 樣品（精確至0.000 1g）置于三角燒瓶中，并準確加入10 mL 3 mol∕L 的硫酸溶液，蓋上表面皿，置于110 ℃烘箱中恒溫水解16 h，然后用濾紙過濾至50 mL容量瓶中，再加入9.5 mL 6 mol∕L 的NaOH 溶液（中和大部分過量的硫酸），定容，取適量溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液待測。

1.6 柱前衍生方法

衍生在自動進樣器上在線自動完成，自動進樣器程序按以下方式先后進行：

（1）吸取2.5 μL硼酸鹽緩沖液；

（2）吸取1.0 μL樣品；

（3）于清洗口混合3.5 μL，5次；

（4）等待0.2 min；

（5）于清洗口洗針，3 s；

（6）吸取0.5 μL OPA；

（7）于清洗口混合4 μL，10 次；

（8）于清洗口洗針，3 s；

（9）吸取0.4 μL FMOC；

（10）于清洗口混合4.4 μL，10 次；

（11）于清洗口洗針，3 s；

（12）吸取32 μL水；

（13）于清洗口混合20 μL，8 次；

（14）進樣。

2 結果與討論

2.1 水解液的選擇

膠原蛋白在酸性條件下可以進行水解，因而試驗時可以選擇用硫酸或鹽酸進行水解。用硫酸溶液可以直接在烘箱中完成水解，且水解時間比用鹽酸溶液水解的時間短，并且整個試驗操作過程也更方便，因而試驗采用硫酸溶液水解羥脯氨酸樣品。

2.2 衍生試劑的選擇

經酸水解后的膠原蛋白可生成多種氨基酸混合物，其中羥脯氨酸、脯氨酸等少數氨基酸屬于二級氨基酸，其他屬于一級氨基酸。在采用高效液相色譜法分析氨基酸時，常用的柱前衍生試劑有丹磺酰氯（DANSYL-Cl）、異硫氰酸苯酯（PITC）、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）和鄰苯二甲醛（OPA）等，且上述衍生試劑各有自身的優缺點[2-7]。其中，OPA因為衍生步驟簡單，反應速度快，衍生物不受剩余試劑干擾，并且可用紫外、熒光或電化學檢測器檢測等優點而被廣泛應用，但OPA 只能與一級氨基酸反應，不能與羥脯氨酸等二級氨基酸反應；而FMOC既能與一級氨基酸反應，也能與二級氨基酸反應。因而選擇將OPA與FMOC聯用，不僅可以克服兩者單獨使用時的缺陷，還有利于對羥脯氨酸的快速、準確測定。

2.3 方法的線性范圍

在選定的色譜條件下測定所配制的一系列標準溶液。以羥脯氨酸的質量濃度為橫坐標，被測物羥脯氨酸的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。結果表明，在9～180 pmol∕L 范圍內，羥脯氨酸的峰面積和質量濃度呈現良好的線性相關性，回歸方程y=9.871 27x+4.331 24，相關系數R2為0.998 6，方法檢出限2.5 mg∕kg。

2.4 方法的回收率和精密度

稱取陰性樣品1.0 g，分別添加低、中、高3種不同質量濃度水平的羥脯氨酸標準溶液，每個濃度水平測定6個平行樣，按照樣品分析步驟1.5處理，進行加標回收率和精密度的試驗，試驗結果詳見表1。由表1 可知，3 種添加方法水平內的平均回收率為96.2%～101.2%，且精密度（RSD）小于3.63%。

表1 樣品中羥脯氨酸的空白回收率（n=6）

2.5 方法的重復性

稱取6 份陽性樣品，按照樣品分析步驟1.5 處理，并在選定的色譜條件下進行測定。測得樣品中羥脯氨酸的質量分數為51.24 mg∕kg，RSD為2.50%，這一結果表明本試驗方法的重現性好。

2.6 膠原蛋白含量的計算及應用

羥脯氨酸屬于膠原蛋白的特異性氨基酸，而一般的蛋白質中并無羥脯氨酸。有資料顯示，膠原蛋白中含有10%的羥脯氨酸[8-9]，因此，通過定量測定水解后羥脯氨酸的含量，再乘以相應的系數，就可以換算測得紡織品中膠原蛋白含量。

3 結論

通過外標法定量，可以采用高效液相色譜熒光檢測器測定紡織品中膠原蛋白的含量。該方法科學合理、簡潔快速、準確度高、重現性好，適用于紡織品中膠原蛋白含量的測定，不僅可以幫助相關企業在生產過程中加強產品質量控制，提高產品品質，還可以幫助業界規范膠原蛋白織物的市場秩序，推動膠原蛋白護膚織物產業的健康發展。