哈爾濱地區小天藍繡球白粉病病原菌鑒定

司修洋 張鵬 劉齊月

摘要 小天藍繡球Phlox drummondii Hook.，又名雁來紅、金山海棠、福祿考，是一種極具觀賞性的一年生草本植物，在我國北方被用來城市綠化。在小天藍繡球的生長過程中，白粉病已成為其所患病害中發生最為嚴重的一種，給小天藍繡球產業造成了巨大的損失，也使其喪失了美化城市的功能。本研究以東北農業大學園藝實驗站的小天藍繡球病葉為材料，對其病原菌進行形態學和分子生物學鑒定，明確其分類地位，為小天藍繡球白粉病的科學防治提供依據。結果表明：小天藍繡球白粉病菌主要侵染葉片，葉片正面布滿白色粉層，后期葉片上產生黑褐色的小點，即閉囊殼。閉囊殼直徑80～160 μm，附屬絲菌絲狀，長度30～210 μm，子囊多個，一個子囊內含有子囊孢子2～8個，分生孢子為粉孢子。對病原菌的ITS序列進行PCR擴增，得到561 bp的序列（GenBank登錄號：MN209867），在GenBank上進行BLAST比對，確定此病菌為Golovinomyces magnicellulatus。

關鍵詞 小天藍繡球; 白粉病; 形態學特征; 分子鑒定

中圖分類號： S 436.8

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019396

Abstract Phlox drummondii Hook.， also known as Yanlaihong， Jinshanhaitang and phlox， is an annual herbaceous plant used for urban landscaping in the north of China. Powdery mildew has become the most serious disease during the growth of P.drummondii， which could cause huge losses and affect its function. In this study， the pathogen of powdery mildew was identified with the method of morphological and molecular identification， which could provide a basis for the scientific control of this disease. The results indicated that the pathogen mainly infected leaves， and the whole leaf was covered with a white powder layer， then abundant dark brown cleistothecia were formed on the leaf. The diameter of cleistothecia was 80-160 μm， the appendages were mycelioid， with a length of 30-210 μm. One ascus contained 2 to 8 ascospores， and the conidium was oidium. The complete internal transcribed spacer （ITS） region of rDNA of the fungus was amplified and sequenced， and the 561 bp sequence was registered in GenBank （accession no. MN209867）. BLAST analysis showed that the rDNA ITS sequence had 99% similarity with that of Golovinomyces magnicellulatus.

Key words Phlox drummondii; powdery mildew; morphological characteristics; molecular identification

小天藍繡球Phlox drummondii Hook.是花荵科Polemoniaceae，天藍繡球屬Phlox一年生草本植物，原產墨西哥[1]，是一種極具觀賞性的花卉，具有花期長，花色艷麗且耐寒耐旱的特點，非常適合在干旱少雨的地方種植。因此，已成為我國北方城市園林綠化的優良地被植物[2]。

近年來，新疆地區的小天藍繡球在生育期頻頻發生白粉病，國慶節未到就過早染病枯萎，喪失了美化城市的功能，因此，城市園林綠化管理者只能采用矮牽牛代替小天藍繡球的辦法[3]。2017年-2018年，小天藍繡球白粉病在哈爾濱地區發病率高達90%，且危害嚴重。本研究通過病原菌形態和ITS序列分析明確了該病原菌的分類地位，為小天藍繡球白粉病的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣本于2018年9月采自哈爾濱市香坊區東北農業大學園藝實驗站，現保存于東北農業大學農學院植物病理教研室。

1.2 病害癥狀觀察

對小天藍繡球白粉病癥狀進行仔細觀察，包括發病部位、病斑顏色、大小和危害程度等[4]。

1.3 病原菌形態學觀察

取干凈的載玻片滴一滴無菌水于載玻片中心。選取發病癥狀典型的小天藍繡球病葉，用無菌針挑取病葉的白粉層和閉囊殼于無菌水中輕微晃動，使其分散，用鑷子夾取蓋玻片，從一側輕輕放下，避免出現氣泡。將玻片放于顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子、閉囊殼、子囊和子囊孢子的形態，并測量相關數據。

1.4 病原菌rDNA ITS片段的PCR擴增和序列測定

白粉菌采用軟毛筆刷取法收集[5]。輕輕地將病葉表面的白粉菌刷至硫酸紙上，收集于無菌離心管中。采用CTAB法[6]提取病原菌基因組DNA。利用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反應體系為25 μL，包括DNA模板1 μL，引物ITS1和ITS4（10 μmol/L）各1 μL，Taq-Plus PCR Forest Mix 48 μL，ddH2O 17.2 μL。PCR擴增程序：94℃預變性3 min;94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸50 s，32個循環;72℃延伸10 min。PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行檢測，產物送往吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，然后在GenBank上進行BLAST同源性比對。

2 結果與分析

2.1 小天藍繡球白粉病的癥狀

小天藍繡球白粉病主要危害葉片，葉的正面、背面均可受害。發病初期葉片上產生放射狀圓形小斑，然后病斑逐漸擴大，并且連成一片，很快整個葉片上布滿了白色粉狀物（圖1），即病原菌的分生孢子，后期白色粉層上產生了深黃色或黑褐色的小顆粒（圖2），即病原菌的閉囊殼。

2.2 病原菌形態特征觀察

閉囊殼球形，直徑80～160 μm，閉囊殼內子囊多個，橢圓形，（50～70）μm×（25～50）μm，1個子囊內通常含有2～8個子囊孢子，子囊孢子圓形或橢圓形。附屬絲菌絲狀，大多彎曲，少數直立，頂端不分支，長度30～210 μm（圖3）。分生孢子為粉孢子，圓形或橢圓形（圖4）。

2.3 rDNA ITS片段的擴增與測序

對小天藍繡球白粉病的病原菌基因組DNA進行PCR擴增，產物直接用于測序，得到長度為561 bp的rDNA ITS序列（GenBank登錄號MN209867）。將測得的序列進行比對分析，結果顯示該序列與GenBank中報道的Golovinomyces magnicellulatus （登錄號AB077621，MK779058）序列相似性均為99%，由此可以推斷，本研究采集的小天藍繡球白粉病菌的有性型為Golovinomyces magnicellulatus。

3 結論與討論

本研究通過形態學鑒定和ITS序列比對分析，證實引起哈爾濱地區小天藍繡球白粉病的病原菌為Golovinomyces magnicellulatus。該種為2013年的中國新記錄種，在遼寧省首先被發現并鑒定，寄主植物是酸漿Physalis alkengi var.franchetii[7]。G.magnicellulatus不僅侵染小天藍繡球，在韓國、意大利還侵染同屬的天藍繡球P.paniculata引起白粉病[8-9]。

國內關于小天藍繡球白粉病病原菌的報道很少。賈菊生等[3]根據病原菌的形態特征，將其有性世代定為福祿考二孢白粉菌Erysiphe cichoracearum DC.f.phlogis Jacz，但未進行相關的分子鑒定。因此，對于不同地域來源的小天藍繡球白粉病樣本，是否存在不同病原菌侵染引起同一種白粉病還有待于進一步研究確認。除新疆地區報道了小天藍繡球白粉病外，其他地區還沒有該病害的報道，這也表明該病害還沒有引起人們的足夠重視。本研究從形態學和ITS序列兩個方面明確了G.magnicellulatus是小天藍繡球白粉病的病原菌，為病害的防控提供了依據。

參考文獻

[1] 方瑞征， 黃素華.中國植物志·第六十四卷第一分冊[M].北京： 科學出版社， 1979.

[2] 楊玉想， 劉金濤， 張娟， 等. 北方地區福祿考的栽培管理[J]. 南方農業， 2010， 4（12）： 68-69.

[3] 賈菊生， 聶述先.誘發新疆福祿考早期衰敗的原因——白粉病[J]. 新疆農業科學， 2000（3）： 126-127.

[4] 遲夢宇， 錢恒偉， 趙穎， 等. 刺槐白粉病病原菌鑒定[J]. 植物病理學報， 2016， 46（5）： 707-709.

[5] 萬三連， 梁鵬， 宋風雅，等. 橡膠樹白粉菌收集及DNA和RNA提取方法比較[J]. 廣東農業科學， 2013（11）： 134-139.

[6] 王文靜， 李成偉. 番茄白粉菌的PCR分子檢測[J]. 河南農業科學， 2010（5）： 72-75.

[7] LIANG C， XING H H， LIU Z， et al. First report of powdery mildew caused by Golovinomyces magnicellulatus var. magnicellulatus on Physalis alkekengi var. franchetii in China [J]. Plant Disease， 2013， 97（10）： 1382.

[8] PARK M J， PARK J H， LEE S G， et al. First confirmed report on powdery mildew of Phlox paniculata caused by Golovinomyces magnicellulatus in Korea [J]. The Plant Pathology Journal， 2010， 26（3）： 295.

[9] GARIBALDI A， BERTETTI D， FRANCO S， et al. Powdery mildew caused by Golovinomyces magnicellulatus on Phlox paniculata in Italy[J]. Journal of Plant Pathology，2016， 98（1）： 176.

（責任編輯：楊明麗）