小麥光腥黑粉菌轉化子最適固體培養基的篩選

李丹丹 何婷 王夢可

摘要 為了篩選小麥光腥黑粉菌轉化子最適培養基，以提高小麥光腥黑粉菌轉化子生長速度，選取了3個菌落形態不同的轉化子（ZHZ-1， ZHZ-2， ZHZ-3）進行培養試驗。用6 mm打孔器打取菌餅，將菌餅置于9種培養基上16℃避光培養。觀察、測量小麥光腥黑粉菌轉化子的菌絲生長情況、菌落直徑等主要指標，結果表明，9種培養基中，3種轉化子都是在完全培養基（complete medium，CM）上生長狀況最好，菌絲生長速度最快。ZHZ-1轉化子在CM培養基上菌落圓形，有褶皺，產生大量白色菌絲，生長速度快。ZHZ-2轉化子菌落圓形，產生大量白色菌絲，生長速度快。ZHZ-3轉化子菌落云紋狀，有褶皺，產生大量白色菌絲，生長速度快。

關鍵詞 小麥光腥黑粉菌; 轉化子; 菌落直徑; 培養基

中圖分類號： S 435.121.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019444

Abstract In order to screen the optimum medium for transformants of Tilletia foetida， to increase the growth rate of transformants of T.foetida， three transformants with different colony morphology， namely ZHZ-1， ZHZ-2 and ZHZ-3， were selected for culture experiment. The 6 mm colony was obtained with a puncher， and was cultured on nine kinds of media at 16℃in the dark. The mycelial growth of the transformants was determined with the colony diameter as the main indicator. The results showed that the three transformants have better mycelium growth rate on complete medium （complete medium， CM） than on the other eight media. Growth pattern of ZHZ-1 transformant on CM medium was as follows： the colony is round and wrinkled， producing a large number of white hyphae， and ZHZ-1 grows fast. The colony of ZHZ-2 transformant is round， producing a large number of white hyphae， and ZHZ-2 grows fast. The ZHZ-3 transformant colonies are irregular， cloud-like and wrinkled， producing a large number of white hyphae， and ZHZ-3 grows fast.

Key words Tilletia foetida; transformant; colony diameter; medium

小麥光腥黑粉菌Tilletia foetida（Wall.）Liro.引起的小麥光腥黑穗病 （common bunt of wheat）是一種全球性、毀滅性的麥類病害[1]。該病害危害嚴重、分布廣泛、流行性強，對小麥的安全生產有破壞性的影響[2-4]。受T.foetida侵染的小麥，在抽穗之前無明顯的癥狀，在小麥生長后期，穎殼向外張開，感病麥粒小且硬，里面充滿黑粉狀的厚垣孢子，感染T.foetida的小麥麥粒散發臭魚腥味，并且釋放出有毒的三甲胺類物質[5-6]。小麥品質降低，產量遭受巨大損失[7-9]。

在南非、美洲和阿富汗等小麥產區，小麥光腥黑穗病的發生對小麥品質造成嚴重影響[10-11]。20世紀50年代初，小麥光腥黑穗病在我國各地都有發生，主要集中在華北和西南部分冬小麥產區，西北和東北地區的春小麥區域[12-13]。小麥光腥黑粉菌屬于擔子菌門Basidiomycotina，冬孢菌綱Teliomycetes，黑粉菌目Ustilaginales，腥黑粉菌科Tilletiaceae，腥黑粉菌屬Tilletia[14]。T.foetida的冬孢子呈褐色，球形或近球形，在土壤中能夠存活多年，一旦條件適宜并遇到大面積的適宜寄主，便會引起發病[15]。國內外主要集中研究小麥光腥黑穗病的病原菌檢測[16-19]，對其致病機制研究較少，該菌自身特性限制了對該菌的研究。

本實驗室前期已獲得58個小麥光腥黑粉菌轉化子，但是由于該菌自身的特性，菌絲生長速度較慢，不利于后續研究。本文隨機挑選3個不同形態的轉化子ZHZ-1， ZHZ-2， ZHZ-3（圖1），分別在9種不同培養基上培養，以篩選出最適合轉化子生長的培養基。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究采用植物病蟲害生物學國家重點實驗室植物保護研究所保存的小麥光腥黑粉菌3個轉化子ZHZ-1， ZHZ-2， ZHZ-3，均為前期通過農桿菌介導的遺傳轉化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）獲得的小麥光腥黑粉菌轉化子。

固體培養基：水瓊脂（water agar， WA），瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。察氏培養基（Czapek-Dox medium， CDA），NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。麥芽糖瓊脂培養基（malt extract agar， MEA），麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar， PDA），馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。玉米粉瓊脂培養基（corn meal agar， CMA），玉米粉30 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL?；九囵B基（minimal medium， MM），NH4NO3 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，Na2HPO4 1.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。YEPSA培養基，酵母提取物10 g，胰蛋白胨4 g，蔗糖4 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（comprehensive potato glucose agar medium， CPDA），馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4 ·7H2O 3.0 g，VB1 0.1 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。完全培養基（complete medium，CM），酵母浸粉1 g，酶水解干酪素0.5 g， 酸水解干酪素0.5 g，葡萄糖10 g，Ca（NO3）2·4H2O 1 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaCl 0.15 g，瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。以上培養基均在121℃高壓滅菌30 min。

1.2 試驗方法

轉化子培養6個月后，將3種轉化子菌種用6 mm的打孔器打取菌餅，將菌餅放到9種不同的固體培養基上，為了防止產生雜菌，并篩選出含有潮霉素抗性的轉化子，培養基中加入300 mg/mL青霉素-鏈霉素雙抗和100 μg/mL潮霉素B，置于16℃培養箱中避光培養，每種培養基設置3個重復，每隔一天測量1次菌落直徑，每5 d記錄1次菌落生長情況。

2 結果與分析

2.1 3種轉化子在CM培養基上培養6個月的菌落形態

由于轉化子形態各異，所以3種轉化子采用不同的轉接方式，ZHZ-1用打取菌餅的方式轉接，ZHZ-2，ZHZ-3采用劃線的方式轉接，3種轉化子形態如圖1所示。ZHZ-1轉化子菌落圓形，菌落內層有褶皺，菌落分3層，內層白色，外層淺灰色，菌絲白色。ZHZ-2菌落圓形，菌絲白色，毛狀。ZHZ-3菌落圓形，菌落外層有淺棕色暈圈，菌絲白色。

2.2 3種轉化子在9種培養基上的生長情況

2.2.1 3種轉化子在9種培養基上的長勢

試驗結果表明：不同培養基對轉化子菌絲生物量有較大影響。3種轉化子在9種培養基上的生長情況差異明顯，但均在CM培養基上長勢最好，菌絲生長速度最快。ZHZ-1轉化子在WA、CDA、MEA、PDA、CMA和MM培養基上生長速度極慢，只長出少量菌絲，相比之下，在YEPSA、CPDA和CM培養基上生長速度較快。ZHZ-2轉化子在WA、CDA培養基上生長出少量白色菌絲，但是，在MEA、PDA、CMA培養基上菌絲幾乎不生長，在MM培養基上生長出少量稀疏的菌絲，與其他6種培養基相比，在YEPSA、CPDA、CM培養基上生長速度較快，菌落圓形，菌絲白色。ZHZ-3轉化子在WA、CDA、MEA培養基上幾乎不生長，且在CDA培養基上菌落呈褐色，在PDA、CMA、MM培養基上生長出少量白色菌絲，與其他兩個轉化子相同的是在YEPSA、CPDA、CM培養基上生長速度較快。3個轉化子生長形態如圖2a～c。

2.2.2 3種轉化子在9種培養基上生長速度

以菌落直徑為指標，明顯看出3種轉化子在9種培養基上生長速度差異很大，共同點為3種轉化子在CM培養基上生長速度最快，明顯快于其他8種培養基，ZHZ-1轉化子在CMA上菌落直徑沒有增長。 ZHZ-2 轉化子在WA、CDA、MEA、PDA、CMA、MM培養基上生長曲線較平滑，生長速度緩慢。ZHZ-3轉化子在WA、CDA、MEA、PDA、CMA、MM培養基上生長30 d后，菌落直徑相差不多（圖3a～c）。

2.3 3種轉化子在9種不同培養基上菌落性狀

ZHZ-1在CDA培養基上生長15 d后菌落沒有擴展，在MEA、PDA、CMA培養基上，ZHZ-1轉化子生長30 d沒有明顯變化，與其他9種培養基相比，在CM培養基上生長速度最快（表1）。ZHZ-2在PDA培養基上15 d以后才出現明顯的生長，在其他8種培養基上，5 d以后就出現明顯的增長（表2）。ZHZ-3在PDA、CMA培養基上20 d后有明顯的增長，在CDA、MEA培養基上15 d有明顯增長，在其他5種培養基上5 d后菌落直徑開始擴大（表3）。

生長緩慢菌落生長緩慢菌落生長緩慢菌絲褐色，菌落褐色圓形，生長緩慢MEA-菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長速度慢

PDA---菌絲白色，菌落點狀分布菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，菌落白色，生長緩慢CMA-菌絲白色，生長速度慢菌絲白色，生長速度慢菌絲白色，生長速度慢菌絲白色，生長速度慢菌絲白色，菌落圓形，生長速度慢MM-菌絲白色，稀疏，菌落圓形菌落生長慢，菌絲白色菌落生長緩慢，菌絲白色菌落生長緩慢，菌絲白色菌落生長慢，圓形，菌絲白色，YEPSA-菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，厚重，菌落圓形有褶CPDA-菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，菌落平滑CM-菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快產生大量白色菌絲，生長較快WA-菌絲褐色，生長較慢菌絲稀疏，生長較慢菌絲稀疏，生長較慢菌絲稀疏，生長較慢菌絲稀疏，生長緩慢CDA---菌絲白色，生長緩慢菌絲白色生長緩慢菌絲白色，菌落厚重，生長緩慢MEA---菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌落白色，生長緩慢，菌落厚重PDA----菌落白色，生長緩慢菌落白色，生長緩慢CMA----菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，菌落白色，生長緩慢MM-菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，點狀分布菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，生長緩慢菌絲白色，稀疏，生長緩慢YEPSA-菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，菌落有褶皺菌絲白色，菌落有褶，菌絲白色，菌落有褶，生長較快CPDA-菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，生長較快菌絲白色，菌落平滑，生長較快CM-菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快菌絲白色，生長速度快產生大量白色菌絲，菌落有褶，生長速度快

3 討論

研究表明，3種轉化子在CM培養基上的生長速度明顯高于在PDA上的生長速度，用不同培養基培養30 d，ZHZ-1在CM培養基上菌落直徑增長了2.07 cm，在PDA培養基上直徑增長了0.06 cm， ZHZ-2在CM培養基上菌落直徑增長了3 cm，在PDA培養基上直徑增長了0.2 cm。ZHZ-3在CM培養基上菌落直徑增長了2.45 cm，在PDA培養基上直徑增長了0.33 cm。

本試驗研究了小麥光腥黑粉菌3種轉化子在9種培養基上的培養性狀和生長速度，結果表明，小麥光腥黑粉菌3種轉化子在CM培養基上生長速度最快，菌絲生長較好。該培養基最適宜3個轉化子的生長，且CM培養基成分價格便宜，來源廣泛，容易獲得，因而是較為理想的培養基，在擴大培養時可以考慮作為首選培養基，以獲得高質量和高數量的小麥光腥黑粉菌轉化子，為后續對該菌致病機制的研究奠定了堅實的基礎。

參考文獻

[1] 何春雨， 杜久元， 張禮軍，等. 小麥腥黑穗病研究進展[J]. 麥類作物學報， 2012，32（3）：589-593.

[2] 翟德緒. 認真防治小麥腥黑穗病[J]. 新農業，1991（1）：21.

[3] ZHANG Min， CHEN Wanquan， LIU Dan， et al. Identification of a specific SCAR marker for detection of Tilletia foetida（Wall.） Liro. pathogen of wheat [J]. Russian Journal of Genetics， 2012， 48（6）：663-666.

[4] 劉丹. 小麥光腥黑粉菌（Tilletia foetida）AFLP分析及其種的特異性SCAR標記的發掘[D].成都： 四川農業大學， 2005.

[5] MAMLUK O F， Bunts and smuts of wheat in North Africa and the Near East [J]. Euphytica， 1998， 100：45-50.

[6] MOURAD A M I， SALLAM A， BELAMKAR V， et al. Genetic architecture of common bunt resistance in winter wheat using genome-wide association study [J/OL]. BMC Plant Biology， 2018， 18：280. DOI：10.1186/s12870-018-1435-x.

[7] YONG P A. A new variety of Tilletia tritici in Monana [J]. Phytopathology， 1935， 25：40.

[8] 王海光，?；墼?，馬占鴻，等. 小麥矮腥黑穗病研究進展與展望[J]. 中國農業科技導報， 2005， 7（4）： 21-28.

[9] 王永鋒， 裴桂英， 馬賽飛， 等. 如何識別小麥腥黑穗病和散黑穗病[J]. 河南農業，2001（5）：18.

[10]DURAN R， FISCHER G W. The genus Tilletia [M]. USA：Washington State University Press， 1957：215-240.

[11]GOATES B J. HOFFMANN J A. Nuclear behavior during teliospores germination and sporidial development in Tilletia caries，T.foetida， and T.controversa [J]. Canadian Journal of Botany， 1987， 65（3）：512-517.

[12]劉丹， 劉太國， 張敏， 等. 小麥光腥黑粉菌（Tilletia foetida）AFLP分析及其種的特異性SCAR 標記[D]. 成都：四川農業大學，2006.

[13]梁宏， 彭友良， 張國珍， 等. 腥黑粉菌屬3種檢疫性真菌rDNA-IGS區的擴增及其序列分析[J]. 植物病理學報，2006， 36（5）：407-412.

[14]HOFFMANN J A. Bunt of wheat [J]. Plant Disease， 1982， 66（11）：979-986.

[15]WIESE M V. Compendium of wheat diseases [J]. Soil Science， 1978， 126（3）：190.

[16]WILLIAMS P C. Incidence of stinking smut （Tilletia spp.） on commercial wheat samples in northern Syria [J]. Rachis， 1983， 2：21.

[17]MULDER D. Plant diseases of economic importance in northern region， United Arab Republic [J]. FAO Plant Protection Bulletin， 1958， 7：1-5.

[18]陳萬權， 劉建華. 小麥矮腥黑穗病菌（TCK）DNA多態性分析及其特異性SCAR標記的發掘[C]∥中國植物病理學會第六屆青年學術研討會. 沈陽， 2003.

[19]?；墼? 小麥矮腥黑穗病在中國的適生區評估[D]. 北京： 中國農業大學， 2005.

（責任編輯：楊明麗）