辣椒疫病抗性的浸根接種鑒定方法

赫衛 張慧

摘要 為建立規模化的辣椒疫病苗期抗性鑒定技術，將辣椒疫霉人工接種于抗疫病辣椒品種‘ICPN21-03和感病辣椒品種‘B16144，研究了接種菌液濃度、接種時期、病情調查時期和接種方法等對人工接種鑒定效果的影響。結果表明，接種菌液游動孢子濃度為10個/mL時，感病品種病情指數為73.37，可以滿足寄主發病的需要;1 ～ 10真葉期接種均能使植株發病，但5 ～ 6真葉期接種能反映抗感病品種真實抗性;接種5 d調查抗感病品種病情指數分別為9.32和73.37，可明顯區別抗感病品種。使用浸根法進行鑒定，需菌量小，對接種環境要求小。用37個辣椒品種進行驗證，鑒定結果表明該苗期抗性鑒定技術可很好地對辣椒品種進行抗性水平分級鑒定。

關鍵詞 辣椒; 疫病; 抗性鑒定

中圖分類號： S 436.418.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019520

Abstract In order to develop a technique for large-scale assessment of the resistance of pepper materials to Phytophthora blight by using artificial inoculation with Phytophthora capsici， the parameters of the inoculation system including levels of inocula， growth stage of seedlings， investigation time and inoculation methods were studied by using ‘ICPN21-03 （resistant to blight） and ‘B16144 （susceptible to blight） in the laboratory. The results showed that the actual levels of plant resistance could be identified at 10 zoospores/mL， in which the disease index of ‘B16144 was 73.37. The true resistance of the varieties could be identified in the seedlings at 5-6-leaf stage， while it could cause Phytophthora blight from 1-leaf to 10-leaf stages. The disease indices of ‘ICPN21-03 and ‘B16144 were 9.32 and 73.37， respectively， 5th day of inoculation， which clearly distinguished between the resistant and susceptible varieties. The efficiency of inoculation by using root-soaking method was well， in which the inoculum concentration and the requirements for inoculation environment were low. The technique was verified by inoculation of 37 pepper varieties. The results suggest that the established assessment system is able to identify the level of plant resistance to P.capsici in pepper seedlings.

Key words pepper; Phytophthora capsici; resistance identification

辣椒是全球第一大蔬菜，疫病是辣椒的主要病害，是由疫霉Phytophthora capsici L.引起的毀滅性真菌病害。控制疫病有多種方式，可以利用分子生物學尋找致病相關基因，如SDA1[1]、CaSBP12[2]等。也可以利用化學藥劑防治，如Tian等[3]合成了16種麥芽酚磺酸鹽衍生物，并分別在體外測定了它們對辣椒疫霉的抗菌活性。Wang等[4]對菜籽粕的生物熏蒸和棉隆的化學熏蒸進行了測試，發現生物熏蒸通過改變土壤微生物群落結構降低了辣椒疫病的發病率。選育和利用抗病品種是防治辣椒疫病最直接、安全、高效的措施之一，有著減少農藥使用，減少對空氣、水和土壤的污染，降低農殘等優點。篩選抗病種質資源一直是抗病育種的重要基礎工作。灌根法是目前最常用的辣椒疫病鑒定方法。譚清群等[5]對24份貴州省辣椒新品種、關天舒等[6]對國內外217份辣椒材料分別采用灌根法鑒定其對疫病的抗性。或者采用果實鑒定法，Naegele等[7]使用果實接種鑒定了來自五大洲45個國家的170種辣椒基因型的疫病抗性。研究人員也在嘗試采用分子手段鑒定辣椒品種的疫病抗性。Liu等[8]找到標記Phyto5NBS1，可用于鑒定疫病抗性相關的5號染色體上主要QTL。Yu等[9]開發了一種基于側流層析試紙條的重組酶聚合酶擴增（LF-RPA）的新型檢測方法，用于快速，無設備檢測辣椒疫霉。本文介紹了一種浸根法，其優點在于簡便易行、需菌量小、無接種環境要求、真實反映系統抗性等，是大規模接種鑒定辣椒疫病的可行方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

辣椒抗病品種‘ICPN21-03和感病品種‘B16144，以及人工接種鑒定所用35份辣椒材料，均由黑龍江省農業科學院園藝分院提供。辣椒播種前進行種子消毒處理，用52～55℃的溫水浸種30 min，10%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，清水沖洗后浸種催芽，播種于育苗缽內。育苗基質為蛭石∶草炭∶土壤=1∶2∶1，134℃ 滅菌30 min后備用。

1.2 疫霉培養

將辣椒疫霉菌種接種在燕麥固體培養基上，在25～28℃暗培養7 d，然后在25～28℃，L∥D=16 h∥8 h培養7 d誘發孢子囊。用無菌水沖洗菌體獲得懸浮液，懸浮液4℃放置30 min，孢子囊破裂，釋放游動孢子，在顯微鏡100倍物鏡下觀察，有透明的游動孢子釋放出來即可用于接種。

1.3 接種

采用浸根法接種。辣椒苗根部用無菌水沖洗干凈，然后用吸水紙拭去表面的水分。50 mL錐形瓶內加入菌液30 mL，每個錐形瓶內插入6株苗，置于溫度28℃光照16 h，25℃黑暗8 h的植物培養箱內，在侵染期間錐形瓶內水缺少時，補充無菌水。每個處理30株苗以上，3次重復，以水處理為對照。

接菌濃度篩選：接菌液游動孢子濃度分別為10、30、100、300、1 000個/mL。在5～6片真葉期接種，接種5 d調查病情。

接種時期篩選：分別在辣椒1～2、3～4、5～6、7～8、9～10片真葉期采用浸根法接種。接菌液游動孢子濃度為10個/mL，接種5 d調查病情。

調查時間篩選：分別浸根3、5、7、9 d調查病情。接種時期為5～6片真葉期，接菌游動孢子濃度為10個/mL。

不同接種方法比較：灌根接種法參考譚清群等[5]的方法，接種后第7 天第1次調查，接種后第14 天第2次調查。果實接種法參考赫衛等[10]的方法，接種后第3 天第1次調查，接種后第5 天第2次調查。

1.4 調查標準

幼苗病情級別分為6級（圖1），其相應的調查標準如下：0級，無癥狀;1級，幼苗根莖部輕微水浸狀病斑，葉片不萎蔫或可恢復性萎蔫;2級，幼苗根莖部水浸狀病斑直徑2～3 cm，葉片不可恢復性萎蔫，下部葉片偶有脫落;3級，幼苗根莖部水浸狀病斑直徑超過3 cm，葉片明顯萎蔫或落葉明顯;4級，幼苗根莖部水浸狀病斑大面積蔓延，除生長點外全部落葉或植株萎蔫;5級，植株枯死。

疫病抗性評價標準：免疫（I），病情指數=0;高抗（HR），0<病情指數≤10;抗病（R），10<病情指數≤30;中抗（MR），30<病情指數≤50;感病（S），50<病情指數≤70;高感（HS），病情指數>70。

2 結果與分析

2.1 接菌濃度的選擇

辣椒苗期疫病發病率及病情指數隨著接種菌液濃度的增大而顯著升高（表1，圖2）。在較高接種菌液游動孢子濃度為1 000、300個/mL和100個/mL時，抗病品種的病情指數分別為76.15、51.98和3594，發病過重，抗性材料變為感病或中抗，不能真實反映品種的抗性水平。感病品種病情指數在3個濃度下無顯著差異，發病均很重。在接種菌液游動孢子濃度為30個/mL或10個/mL時，抗病品種的病情指數分別為16.11和9.32，感病品種的病情指數分別為8385和73.37，能夠真實反映材料本身的抗病性，且抗病品種與感病品種的病情指數差異顯著，能明顯區分抗感品種，而接種菌液游動孢子濃度在10個/mL時，用菌量更少。因此在苗期人工接種鑒定中，適宜的接種菌液游動孢子濃度確定為10個/mL。

2.2 接種寄主苗齡對鑒定效果的影響

接種寄主的苗齡對疫病接種效果影響較大（表2，圖2），隨著苗齡的增長，植株的抗病力增強，發病延遲。1～2、3～4、5～6、7～8、9～10片真葉期接種的病情指數差異顯著;其中5～6片真葉期接種的抗感病品種的病情指數分別為9.32和73.37，病情指數大小適中，真實反映了材料本身的抗病性。1～2片真葉期接種的抗感病品種明顯萎蔫或枯死，其對照水處理出現莖基部腐爛的癥狀，干擾了病情指數調查。出現這種情況可能是苗齡過小，莖基部沒有木質化，經受不住多天的液體浸泡。1～2、3～4片真葉期接種的抗病品種的病情指數分別為59.93和3060，7～8、9～10片真葉期接種的感病品種病情指數分別為61.06和4629，不能反映材料的真實抗性水平。在7～8、9～10片真葉期，苗齡過大，植株抵抗病害的能力較強，侵染進程和發病時間較長。此外，9～10片真葉期苗齡過大，有向生殖生長轉變的趨勢。因此最佳接種苗齡為5～6片真葉期。

2.3 病情調查時期的選擇

試驗結果表明，在游動孢子懸浮液濃度10個/mL處理下，辣椒幼苗疫病發病率及病情指數隨著處理時間的延長而升高，各處理間差異顯著（表3，圖2）。接種3 d后，感病品種葉片多為可恢復性萎蔫，病情指數為27.76，發病太輕，不能真實地反映品種的抗性水平。接種7 d后，抗病品種的植株為可恢復性或不可恢復性萎蔫，病情指數為31.84，感病品種的植株呈明顯萎蔫或枯死的狀態，發病重，不能真實反映品種的抗性水平。接種9 d后，抗感病品種都表現為明顯萎蔫或枯死，發病過重。接種5 d后，不萎蔫、可恢復性萎蔫、不可恢復性萎蔫、落葉明顯、枯死的植株并存，抗病品種與感病品種的病情指數分別為9.32和73.37，差異顯著，易區分抗感品種，能真實地反映品種的抗性水平。因此適宜的病情調查時期為接種第5天。

2.4 不同接種方法的比較

采用3種方法接種均可以有效區分抗感病品種，抗病品種‘ICPN21-03和感病品種‘B16144的病情指數差異顯著（表4）。比較3種接種方法，發病最快且嚴重的為果實接種法，接種第3天即表現為菌絲擴散，出現水浸狀病斑，抗病品種‘ICPN21-03的病情指數為19.70，顯著高于浸根法的9.32（5 d）和灌根法的8.21（7 d）。

果實接種法發病重于其他兩種方法。第一次調查時，浸根法（5 d）的抗病品種和感病品種的病情指數分別與灌根法（7 d）無顯著差異，與鑒定寄主抗感情況一致，但抗、感病品種的發病率（40.76%和100%）顯著高于灌根法（22.82%和84.38%），發病整齊度更好。第二次調查時，浸根法（7 d）的抗病品種的病情指數顯著高于灌根法（14 d）。說明浸根法可用于疫病鑒定，具有發病快、發病整齊的特點。

2.5 辣椒種質資源的抗病性鑒定

采用浸根法對辣椒品種的疫病抗性進行分級，不同品種呈現抗性明顯不同。根據病情指數與抗病性的關系對37個品種進行鑒定（表5），其中鑒定為高抗（HR）的僅2個品種，抗病（R）品種11個，中抗（MR）品種6個，感病（S）品種12個，高感品種（HS）6個。說明采用浸根法可以將不同辣椒品種進行很好的抗性水平分級。

3 結論與討論

本試驗建立了一種適合辣椒疫病的苗期抗性鑒定方法，即在苗齡為5～6片真葉期時采用浸根法接種，接種游動孢子懸浮液濃度為10個/mL，接種5 d后調查發病率和病情指數。利用辣椒品種對建立的鑒定方法進行了驗證，該苗期抗性鑒定方法可很好地對辣椒品種進行抗性水平分級鑒定，表明該方法可用于辣椒抗性材料的篩選。本研究采用6級分級標準，與灌根法采用的分級標準大體一致。灌根法在接種試驗中應用比較多，但該方法接種菌液濃度高，對菌液的需求量大，而研究者采用固體培養基培養疫霉[5-6]，疫霉大量擴繁困難，工作量大。本研究通過不同菌液濃度對辣椒疫病抗性鑒定的影響試驗，證明游動孢子懸浮液僅僅10個/mL的濃度就可以達到辣椒疫病浸根法接種的濃度需求，能夠真實反映辣椒幼苗本身的抗性，與灌根法接種疫霉游動孢子濃度1 000個/mL相比，菌濃度大大降低，不需要大量擴繁疫霉。浸根法接種寄主苗齡為5～6片真葉期，與灌根法的第6片真葉展平期相近。本研究發現，辣椒1～10葉期接種均能發病，但接種苗齡越大，植株本身的抗病性越強，疫病發生時間也隨之推遲。果實接種法是離體接種，要求嚴格控制濕度，灌根法在接種期間要適時澆水，保持土壤濕度近飽和狀態。浸根法根部直接暴露在菌液中，沒有土壤環境的干擾，利于發病，且不需要控制濕度。與灌根法和果實接種法相比，本研究建立的接種方法具有菌需求量小，需求空間小，對接種環境要求小，鑒定時間短等優點，適于大批量種質資源的篩選。本研究可為辣椒抗病育種工作提供技術支持。

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（責任編輯：楊明麗）