澧縣‘紅地球’葡萄表面黑色組曲霉種群結構及產毒情況研究

頁非 黃曉慶 王忠躍

摘要 葡萄和葡萄制品面臨著真菌毒素的威脅，這些真菌毒素主要來自于黑色組曲霉Aspergillus section Nigri。本研究對采自湖南省澧縣‘紅地球葡萄上的黑色組曲霉進行了分離鑒定及種群結構分析，并采用超高效液相色譜串聯質譜技術（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）對12株代表菌株產赭曲霉毒素（ochratoxin A， OTA）和伏馬毒素B2（fumonisin B2， FB2）的能力進行了測定。結果表明，澧縣地區‘紅地球葡萄帶菌率為92%?；阝}調素序列，分離得到的131株黑色組曲霉分屬于5個種，其中A.aculeatinus為優勢種。12株代表菌株均不產生OTA;A.welwitschiae（4/5）及A.niger（2/2）可產生FB2，平均產毒量分別為336 ng/g及741.37 ng/g。上述結果為評估國內葡萄表面黑色組曲霉及其毒素的污染風險提供參考。

關鍵詞 葡萄; 黑色組曲霉; 赭曲霉毒素（OTA）; 伏馬毒素B2（FB2）

中圖分類號： S 436.631.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019422

Abstract Grapes and grape products are threatened by mycotoxins， caused by some species of Aspergillus section Nigri. In this study， based on calmodulin gene sequencing， using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， the Aspergillus section Nigri population and its toxigenicity in grapes in Lixian county of Hunan province were studied to confirm the food safety of table grapes. A total of 131 Aspergillus section Nigri strains were isolated from grape samples with the isolation frequency was 92%， and five species of Aspergillus section Nigri were identified， with A.aculeatinus as the dominant species. The mycotoxin tests of 12 isolated strains showed that none of them produced ochratoxin A. A.welwitschiae （4/5） and A.niger （2/2） could produce fumonisin B2， with an average toxin yield of 3.36 ng/g and 741.37 ng/g， respectively. This study provided a reference for evaluating the occurrence of Aspergillus section Nigri and its toxigenicity on the surface of grapes in China.

Key words grape; Aspergillus section Nigri; ochratoxin A; fumonisin B2

葡萄作為鮮食水果不僅肉多汁甜，還有著極高的營養價值，一直深受消費者喜愛。然而由于鮮食葡萄中可溶性固形物含量極高，并且果皮薄而嫩，導致其在生長期間以及采后運輸、貯藏過程中極易破損從而遭受各類真菌的感染，進而產生不同的真菌毒素，并且這些真菌毒素也會隨著后續加工進入各類葡萄制品中，給食品的質量安全帶來了隱患，對人類的健康構成了威脅。研究發現，當溫度高于37℃并且空氣濕度較大時，葡萄極易遭受曲霉屬Aspergillus真菌的污染[1]。黑色組曲霉Aspergillus section Nigri是曲霉屬一個重要類群，至少包含27個種[2]，其與葡萄酸腐?。╣rape sour rot）和曲霉黑腐?。ˋspergillus black rot）聯系緊密。酸腐病是危害許多葡萄品種的一種收獲前病害，其癥狀包括漿果開裂和漿果組織被破壞等，是一種復雜的病害，其病原涉及多種絲狀真菌和細菌[3]。相關研究表明，黑色組曲霉能夠引起葡萄酸腐病[4]。在美國加利福尼亞州，炭黑曲霉A.carbonarius及黑曲霉A.niger是造成葡萄酸腐病的主要種[3]。曲霉屬真菌引起的黑腐病也是發生在葡萄上的眾多腐爛病害之一，主要由黑色組曲霉引起[5]。這種病以黑腐病的形式出現在漿果上，表現為大量的真菌孢子侵入漿果使其完全變成空殼且干燥。病原菌分布于漿果表皮，隨采收進入貯藏空間，對漿果有潛在威脅[6-7]。除了產量損失外，曲霉屬真菌中的部分種能產生真菌毒素，污染葡萄及其制品，造成食品安全上的重大隱患。研究表明，黑色組曲霉中炭黑曲霉等5個種可以產生赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）[8-9]，黑曲霉與A.welwitschiae可以產生伏馬毒素B2（fumonisin B2， FB2）[10-12]，黑曲霉可產伏馬毒素B4（FB4）[13]。

赭曲霉毒素是由赭曲霉A.ochraceus、炭黑曲霉及疣孢青霉Penicillium verruculosum等產毒菌所產生的一種有毒代謝產物[14]，其中赭曲霉毒素A（OTA）分布最廣，毒性最強。聯合國世界衛生組織國際癌癥研究機構在1993年將赭曲霉毒素A（OTA）列為人類2組B類致癌物，可造成人體腎臟、神經系統以及免疫系統損傷，進而誘發畸變、癌變等[15-18]。伏馬毒素由 Gelderblom等[19]首次從串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme的培養液中分離出來，是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯化合物。在收割、儲藏和加工等采后各個環節中極易污染糧食、水果和蔬菜等各種農副產品[20-21]。伏馬毒素對人體和動物的損害極大，研究表明，伏馬毒素與食管癌高發具有極高的關聯性[22]。這兩種毒素廣泛存在于各種食物中，如谷物制品、咖啡、香料等，水果中主要以葡萄及其制品為主[23-26]。目前，葡萄及其制品真菌毒素污染的相關研究主要集中在國外，據報道葡萄在生長及儲運的各個階段均會受到黑色組曲霉的污染[27-29]，且不同品種對產毒菌侵染和毒素積累的抗性水平有明顯差異[30]。Qi等發現加拿大32%的鮮果葡萄中含有FB2，含量在1～15 ng/g[31]。葡萄酒中真菌毒素污染則更為普遍，歐洲各國葡萄酒中OTA檢出率為17%～98%，南美洲為8%～40%，大洋洲澳大利亞為15%，北非摩洛哥高達100%[32]。Christopher等對產自美國11個葡萄產區的41份葡萄酒樣品進行檢測，發現OTA污染率高達74%[33]。國內關于真菌毒素在葡萄及其制品上的污染的研究較少，主要集中在葡萄酒的真菌毒素污染情況及檢測方法[34-37]方面，少部分關于葡萄鮮果污染情況的相關研究[38]。隨著國外關于葡萄及其制品被曲霉毒素污染的報道逐漸增多，葡萄上真菌毒素的污染問題也越來越被重視。

湖南澧縣以盛產優質葡萄出名，但由于該地區地處于亞熱帶季風氣候區，夏季高溫多雨的氣候適宜曲霉的生長，鮮果遭受曲霉污染的風險較大。本研究以澧縣地區鮮食葡萄‘紅地球為對象，采用表皮分離培養法對葡萄表面黑色組曲霉進行分類，基于鈣調素序列鑒定分析其種群結構，利用超高效液相色譜串聯質譜技術（UPLC-MS/MS）對其產毒情況進行檢測，以期為鮮食葡萄的食品安全評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采集于2018年9月上旬。在澧縣地區選擇3個葡萄園，品種為‘紅地球，處于成熟期。每個葡萄園采集7～8個果穗，各果穗之間相隔10 m，在每個果穗上剪取2粒健康葡萄，共采集50粒。

葡萄糖及蔗糖購于北京化工廠;瓊脂、酵母膏、磷酸氫二鉀、七水硫酸亞鐵、七水硫酸鎂、硝酸鈉、氯化鉀、五水硫酸銅購于國藥集團化學試劑有限公司;色譜甲醇、色譜乙腈，色譜甲酸購于Thermo Fisher Scientific;E-Z96真菌基因組DNA提取試劑盒（D3390-02）購于OMEGA;FB2、OTA標準品購于Pribolab。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑色組曲霉的分離

用滅菌的手術刀與手術鑷從健康葡萄樣品上3個不同的部位取下大約0.5 cm×0.5 cm大小的果皮，按照三點接種法且外果皮朝下放置在CYA培養基[2]上，一粒葡萄對應一皿，共50皿。將樣品倒置于培養箱25℃黑暗處理3～5 d，待葡萄表皮周圍長出菌落，統計帶菌率。

1.2.2 黑色組曲霉菌種的分子鑒定

將葡萄果皮周圍的菌落逐一轉接于另一干凈的CYA平板上進行純培養，并對菌株進行編號。用接種針挑取新培養好的目標菌落的孢子囊于含有1 mL無菌水的離心管中，用移液槍吸打形成孢子懸浮液，吸取2 μL孢子懸浮液制成臨時玻片在顯微鏡下觀察，并逐步稀釋，直至孢子懸浮液濃度約為1×105個/mL。取2 μL在 CYA培養基上劃線，隨后于霉菌培養箱25℃黑暗培養1～2 d。從劃線部位選取單個菌落，用滅菌接種針挑至新的CYA平板中，重復3皿，倒置于霉菌培養箱25℃黑暗培養3～4 d。選取一皿切下長×寬約為1.5 cm×0.5 cm的菌條放入2 mL凍存管，加入30%甘油，放置在-80℃冰箱保存;另選取一皿刮下菌絲置于凍存管中用于DNA的提取。

利用E-Z96真菌基因組DNA提取試劑盒提取曲霉的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，利用引物[2]CMD5（5′-CCGAGTACAAGGARGCCTTC-3′）和CMD6（5′-CCGATRGAGGTCATRACGTGG-3′）進行Calmodulin（CaM）基因保守序列的PCR擴增，片段大小約為600 bp。PCR反應體系為50 μL，0.4 mol/L上、下游引物各2 μL，Mix 25 μL，DNA模板2 μL，超純水19 μL。PCR擴增條件為：94℃預變性10 min;94℃變性15 s，55℃退火30 s，70℃延伸40 s，35個循環;最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖電泳檢測。PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，利用Geneious軟件BLAST功能將測序結果與黑色組曲霉Calmodulin基因參考序列[2]進行比對，得到菌種鑒定結果。

測序結果采用Geneious軟件進行單倍型序列鑒定，將單倍型序列采用ClustalW方法進行多序列比對，然后采用RaxML 8.0軟件GTRGAMMA模型構建最大似然樹。根據系統發育樹聚類結果，確定菌株所屬種。

1.2.3 毒素檢測

根據相關文獻報道[8-12]，從分離的菌株中選擇可能產毒的菌種， 包括5株塔賓曲霉A.tubingensis、5株百歲蘭曲霉A.welwitschiae、2株黑曲霉Aniger共12株。對這12株菌株進行活化。吸取1 μL保存的孢子懸浮液置于6 cm PDA培養基上，倒置培養3～4 d，用手術鑷夾取少量菌絲置于1 mL去離子水中，振蕩混勻，吸取2 μL滴于9 cm CYA培養基中央，黑暗倒置培養12 d。第13天使用規格3 mm的打孔器在菌落中心取10個瓊脂栓放入5 mL離心管，稱重并加入1.5 mL色譜純甲醇[39]，振蕩3 min，黑暗靜置1 h以上。將靜置后的提取物10 000 r/min離心10 min，上清液先后經045 μm和0.22 μm微孔濾膜過濾。取1 mL過濾的溶液打入2 mL色譜瓶內，使用UPLC-MS/MS進行毒素檢測。

FB2標準品濃度梯度設置為 5、25、50、100、250、500 ng/mL，OTA標準品濃度梯度設置為25、50、100、250、500 ng/mL。流動相由0.1%甲酸（A）和乙腈（B）組成。線性梯度洗脫程序如下：0 min 90% B，1.5 min 10% B（保持1 min），2.6 min 90% B， 保持5 min平衡。流速為0.3 mL/min，進樣量2 μL。質譜測定參數見表1。通過全掃描/質譜多反應監測技術（multiple reaction monitoring， MRM）確定FB2及OTA的質子化離子峰，二級質譜分析得到各自碎片離子的信息，選取碎片離子峰值相對較高的 2 個碎片離子作為定量離子和定性離子。Intelistart 自動優化各質譜參數。

2 結果與分析

2.1 帶菌率分析

本研究總共采集50份葡萄樣品，其中46份樣品分離到黑色組曲霉，帶菌率為92%，共分離得到131株黑色組曲霉。

2.2 菌種鑒定及病原菌的種群結構分析

研究表明，黑色組曲霉總共有27個種[2]，可以分為兩個獨立的演化分支，分別為A.BISERIATE以及A.UNISERIATE[2]。其中A.BISERIATE包含與毒素產生相關的兩個復合群，分別為A.carbonarius clade及A.niger “aggregate”clade[2]。由圖1～2可知，在澧縣地區分離得到的131株曲霉菌屬于5個種，分別為A.aculeatinus、A.tubingensis、A.welwitschiae、A.niger和A.brunneoviolaceus。其中A.aculeatinus及A.brunneoviolaceus屬于AUNISERIATE中的A.aculeatus clade復合群;Awelwitschiae和A.niger屬于A.welwitschiae clade，A.tubingensis屬于A.tubingensis clade，A.welwitschiae clade和A.tubingensis clade，統稱為A.niger “aggregate”clade，屬于A.BISERIATE。

分離得到的131株菌株中A.aculeatinus數量最多，有96株，占73.3%;其次為A.tubingensis，26株，占19.8%;A.welwitschiae較少，僅有5株，占3.8%;Aniger與A.brunneoviolaceus分別僅有2株，各占15%。在澧縣地區的黑色組曲霉中A.UNISERIATE占比高達74.8%，其余25.2%均屬于A.BISERIATE分支中的A.niger “aggregate”clade，而另一重要產毒復合群A.carbonaris clade在澧縣地區未分離到。

2.3 毒素檢測結果

本試驗選擇了5株A.tubingensis、5株A.welwitschiae以及2株A.niger進行毒素檢測。由圖3可知，兩種毒素標準曲線線性良好，R2分別為0999 7和0.996 4，可用于定量檢測。由表2可知，12株菌中共有6株可產生FB2，其中5株A.tubingensis均不能產生FB2;5株A.welwitschiae中有4株可產生FB2，FB2平均產量為3.36 ng/g，其中產量最高的為菌株127及菌株128，兩株菌株FB2產量均為5.13 ng/g;2株A.niger均產生FB2，且產毒量遠高于A.welwitschiae，分別達到了624.15 ng/g及858.58 ng/g，平均產量741.37 ng/g。在12株檢測菌株中，未發現能夠產生OTA的菌株。

3 討論

本研究發現，澧縣地區的‘紅地球葡萄黑色組曲霉帶菌率較高，根據前期研究，推測是因為當地夏季高溫高濕，十分適宜黑色組曲霉的生長[1]。本研究在湖南省澧縣共鑒定到5種黑色組曲霉，優勢種為A.aculeatinus，與其他國家相比，種群組成有明顯差異。塞浦路斯[40]地區共分離得到5種黑色組曲霉，優勢種為A.tubingensis;意大利[41]及加拿大[31]均鑒定得到6種黑色組曲霉，優勢種分別為A.tubingensis及A.welwitschiae;在澧縣地區AUNISERIATE分支占比最高;A.BISERIATE分支中A.niger “aggregate” clade次之，并未分離到A.carbonarius clade;在阿根廷[27]、意大利[41]及以色列[42]對葡萄表面黑色組曲霉種群組成研究中，A.niger “aggregate” clade占比最高，A.UNISERIATE次之，A.carbonarius clade最少，但也均高于7.0%;在西班牙[28]、法國[43]及澳大利亞[44]的相關研究中，A.niger “aggregate”clade占比最高，Acarbonarius clade次之，A.UNISERIATE最少。澧縣地區的黑色組曲霉種群組成與上述報道葡萄種植區存在較大差異，這可能與地區間氣候條件差異有關。毒素測定結果表明，被檢測的A.tubingensis、A.welwitschiae及A.niger菌株均不產生OTA，大部分A.welwitschiae產生FB2[31]。與已有報道相同[29]，A.niger全部可產生FB2，且產毒量較高。此前有報道認為A.tubingensis[45]可產生OTA，但最新研究表明其為不產OTA種群[46]，本研究也證實了這一結論，所有檢測的A.tubingensis均不產生OTA。有相關文獻報導黑曲霉A.niger可產生OTA[47]，但頻率較低，比例分別為3.0%（8/257）[48]及16.7%（5/30）[49]，也有文獻報道未檢測到產OTA的A.niger菌株[50]。本研究測定的Aniger菌株均不產生OTA，說明A.niger造成的OTA污染在這一區域風險較低。菌種A.niger是否產生OTA毒素以及其產毒特性還值得研究。綜上，澧縣地區的黑色組曲霉帶菌率較高，有潛在的病害威脅。但產毒種頻率較低，對澧縣葡萄可能造成毒素污染風險的為A.niger以及A.welwitschiae產生的FB2。根據本研究結果，應進一步開展采后貯藏期間的葡萄樣品檢測，對黑色組曲霉進行持續監測，并且加大樣本量對毒素污染風險繼續進行更深入的評估。

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（責任編輯：田 喆）