癭蚊科3種昆蟲核糖體DNA的克隆及序列分析

段云 郭培 鞏中軍

摘要 癭蚊科是雙翅目昆蟲中的重要類群。本研究對癭蚊科3種昆蟲—麥紅吸漿蟲、菊花癭蚊和食蚜癭蚊的核糖體DNA進行PCR擴增、克隆、測序及序列分析，并對ITS-1在麥紅吸漿蟲4個地理種群中的遺傳變異情況進行分析。結果表明，從3種昆蟲中獲得的核糖體DNA序列包括：部分的18S rDNA（44 bp）、28S rDNA（37 bp），全部的ITS-1（487～535 bp），5.8S rDNA（121 bp）及ITS-2（336～352 bp）序列。3種昆蟲ITS序列的堿基差異百分比在17.21%～29.59%之間，共含有206個變異位點。ITS-1序列在麥紅吸漿蟲4個地理種群中比較保守，只有4個變異位點，單倍型多樣性為0.311 7～0.796 5，核苷酸多樣性為0.000 6～0.002 2。本研究為今后癭蚊科昆蟲的分類鑒定、系統發育和遺傳進化等相關研究提供了基礎。

關鍵詞 癭蚊科; 核糖體DNA; 序列分析; 分子鑒定

中圖分類號： Q 963

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019400

Abstract Cecidomyiidae is an important insect group in the order Diptera. The ribosomal DNAs from three gall midges， Sitodiplosis mosellana， Rhopalomyia longicauda and Aphidoletes aphidimyza， were studied by PCR amplification， cloning， sequencing and sequence analysis. The genetic variation of ITS-1 in four geographical populations of S.mosellana was analyzed. The results showed that the rDNA sequences of three insects included partial sequences of 18S rDNA （44 bp） and 28S rDNA （37 bp）， complete sequences of ITS-1 （487-535 bp）， 5.8 S rDNA （121 bp） and ITS-2 （336-352 bp） sequences. The difference among ITS sequences was between 17.21% and 2959%， including a total of 206 variant sites. There was little difference in the ITS-1 sequence among the four geographical populations of S.mosellana， with only 4 variant sites， a haplotype diversity of 0.311 7-0.796 5， and a nucleotide diversity of 0.000 6-0.002 2. This study provides a basis for the study of identification， phylogeny and genetic evolution of gall midges of the Cecidomyiidae family.

Key words Cecidomyiidae; ribosomal DNA; sequence analysis; molecular identification

癭蚊科Cecidomyiidae隸屬于雙翅目Diptera，是一類雄蟲觸角具環毛，翅上顯著縱脈不超過5條的蚊類昆蟲。由于該科許多種類昆蟲的幼蟲在植物上形成蟲癭，故通稱為癭蚊[1]。癭蚊科是具有重要經濟意義的一個大科，在世界范圍內廣泛分布[2]。目前，全球已知的癭蚊科昆蟲有6 590多種，其中包括多種為害農作物、蔬菜、花卉、樹木和果樹的重要害蟲[3]，如麥紅吸漿蟲Sitodiplosis mosellana、黑森癭蚊Mayetiola destructor、菊花癭蚊Rhopalomyia longicauda、刺槐葉癭蚊Oblodiplosis robiniae和高粱癭蚊Contarinia sorghicola等，也包括若干捕食蚜蟲、螨類和介殼蟲等的天敵昆蟲，如食蚜癭蚊Aphidoletes aphidimyza和Feltiella acarisuga等[4-7]。

目前，癭蚊科昆蟲已成為研究昆蟲-寄主之間協同進化的重要材料。傳統的癭蚊科昆蟲種類鑒定主要以形態學特征為依據，對于相近種，特別是對于幼蟲和卵，利用形態學特征鑒定存在很大的局限性，而以DNA序列為基礎的分子鑒定，結果更加準確可靠。目前已開發的癭蚊科昆蟲DNA分子標記還相對較少，且主要集中在線粒體基因的應用上[5，8-10]，而關于核基因序列的相關研究卻很少[11]。

內轉錄間隔區（internal transcribed spacer， ITS）是高度重復的核糖體DNA（rDNA）中介于18S rDNA和28S rDNA之間的內轉錄間隔區，包括存在于18S rDNA和5.8S rDNA之間的內轉錄間隔區1（ITS-1）和存在于5.8S rDNA和28S rDNA的內轉錄間隔區2（ITS-2）兩個序列[12-13]。ITS受外界環境因素的影響較小，與編碼區域相比具有進化速度慢的特點，在種內具有高度的保守性，在不同種間及亞種間又表現出極大差異[14]。同時，ITS具有大量的拷貝，很容易進行PCR擴增[15]。因此，ITS作為一種重要的分子標記和線粒體DNA信息的補充，在昆蟲學的研究中越來越受到重視，并且已被廣泛用于昆蟲分類學、昆蟲分子系統學研究中，在物種鑒定、（種內和近緣種的）親緣關系和系統發育分析、遺傳進化、擴散/傳播及昆蟲與環境的關系等方面的研究中起著重要的作用[13，15-16]。

本研究采用通用引物對癭蚊科3種昆蟲（麥紅吸漿蟲、菊花癭蚊和食蚜癭蚊）的核糖體DNA序列進行PCR擴增、克隆及序列分析，同時以我國4個地理種群的麥紅吸漿蟲為研究對象，PCR擴增其ITS-1，并進行序列的變異情況分析。希望本研究能夠為今后癭蚊科昆蟲的分類、物種鑒定、親緣關系和系統發育關系分析等方面的研究提供新的DNA分子標記。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

菊花癭蚊成蟲采自河南省溫縣，食蚜癭蚊成蟲由衡水田益生防有限責任公司提供，為室內飼養的天敵產品。麥紅吸漿蟲4個地理種群的樣品分別為2012年4月-5月份期間采自河南省輝縣、河南省欒川縣、寧夏回族自治區銀川市和山西省臨汾市發生麥紅吸漿蟲地塊的土樣。將含有麥紅吸漿蟲幼蟲的土樣放于溫度（22±1）℃、相對濕度70%～75%，光周期L∥D=14 h∥10 h的條件下讓其羽化。收集剛剛羽化的成蟲，放于75%乙醇中，-20℃保存備用。

1.2 昆蟲基因組DNA（gDNA）的提取

3種昆蟲基因組DNA的提取方法參照段云等[17]的方法。提取的總DNA用超純水溶解后，用0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA的提取效果，然后保存于-20℃備用。

1.3 核糖體DNA的PCR擴增

1.3.1 引物設計與合成

根據GenBank中登錄的雙翅目昆蟲核糖體DNA序列，設計1對用于擴增癭蚊科昆蟲核糖體DNA序列的引物，Cec-F：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′，Cec-R：5′-ATGYAAATTYAGGGGGTAGTC-3′。同時設計合成用于擴增麥紅吸漿蟲ITS-1基因序列的引物，ITS-1F： 5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′，ITS-1R： 5′-GATGTTCATGTGTCCTGCAGT-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.2 PCR擴增

以提取的昆蟲總DNA為模板進行PCR擴增。其中，擴增麥紅吸漿蟲ITS序列的樣品來自河南輝縣。反應總體積為20 μL，包含10×buffer（Mg2+ free）2 μL，25 mmol/L Mg2+1.8 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 pmol/L）1 μL，下游引物（10 pmol/L）1 μL，超純水10.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）（大連TaKaRa公司）0.2 μL，含有20～40 ng DNA的模板1.5 μL。PCR反應在SensoQuest LabCycler 2.2型PCR儀上進行，反應程序為：94℃預變性4 min;95℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環;72℃延伸10 min終止反應。

電泳檢測：PCR反應結束后，在8 μL PCR反應產物中加入1.6 μL 6×DNA上樣緩沖液后，用1.0%瓊脂糖電泳進行檢測。

1.3.3 PCR產物的純化、克隆和測序

利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，回收后的DNA連接到pMDTM19-T載體中，轉化大腸桿菌TG1感受態細胞，鑒定陽性轉化子后，將菌液送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

麥紅吸漿蟲4個地理種群ITS-1的PCR產物，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由生工生物工程（上海）有限公司完成PCR產物的純化及測序。

1.3.4 序列分析

所測序列通過Chromas軟件進行讀取。在NCBI網站上（www.ncbi.nlm.nih.gov）利用BLAST軟件對獲得的ITS序列進行同源性比對分析，排除有外源污染的序列，然后將序列提交GenBank，獲得GenBank登錄號。

利用MEGA 4.0軟件[18]對3條ITS序列（ITS-1和ITS-2）進行序列比對分析，并輔以人工校正。然后進行堿基組成、多態位點和遺傳距離分析;利用SSR Finder軟件（http：∥www.fresnostate.edu/ssrfinder/）對ITS序列進行重復序列的在線查找，查找標準為：單核苷酸重復12次以上，二核苷酸重復6次以上，三核苷酸的重復5次以上，四核苷酸以上的重復4次以上。利用DnaSP v5軟件[19]和MEGA 4.0軟件對ITS-1在麥紅吸漿蟲種內的遺傳變異情況進行分析，分析內容包括計算核苷酸變異位點（variable sites）、多態性位點（polymorphic sites）、簡約信息位點數（parsimony informative polymorphic sites）、單倍型多樣性（haplotype diversity）和核苷酸多樣性（nucleotide diversity）等。

2 結果與分析

2.1 ITS的PCR擴增、克隆及序列分析

運用擴增癭蚊科昆蟲核糖體DNA的引物（Cec-F和Cec-R）對3種癭蚊科昆蟲的gDNA進行PCR擴增，然后經克隆、測序及序列分析，最終從麥紅吸漿蟲、菊花癭蚊和食蚜癭蚊中各獲得一條長度為1 059、1 042 bp和1 073 bp的核DNA序列，其中包含18S rDNA（44 bp）、5.8S rDNA（121 bp）、28S rDNA（37 bp）、ITS-1（487～535 bp）和ITS-2（336～352 bp）的序列。序列比對分析發現，從3種昆蟲中擴增出的18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA序列都非常保守，同源性達100%。將這3條序列提交到GenBank，獲得GenBank登錄號為：MH734104—MH734106。序列的比對分析結果顯示，3種昆蟲的ITS（ITS1+ITS2）序列長度變化較大，菊花癭蚊的ITS序列的長度最短，為839 bp，食蚜癭蚊的ITS序列最長，為871 bp。ITS-1的片段長度在487～535 bp，其中來自菊花癭蚊的ITS-1序列最短（487 bp），來自食蚜癭蚊的ITS-1序列最長（535 bp）;ITS-2序列長度在336～352 bp，其中食蚜癭蚊的ITS-2序列最短（336 bp），菊花癭蚊的ITS-2序列最長（352 bp）。重復序列查找的結果表明，在麥紅吸漿蟲的ITS-1序列中含有一個重復序列（AAAT）4，在菊花癭蚊的ITS-1序列中含有一個重復序列（TTGTG）4，而在食蚜癭蚊中沒有發現重復序列。

2.2 ITS的堿基組成分析

堿基組成分析結果表明，在3種昆蟲的ITS序列中，A、G、C、T的百分含量都較穩定，分別在330%～34.8%，15.4%～15.6%，11.7%～126%，37.5%～38.9%，在4種堿基中，T的含量最高。A+T的含量差異不大，除來自菊花癭蚊ITS-2序列的A+T含量與來自麥紅吸漿蟲和食蚜癭蚊的差異大于1%外，其他片段的A+T含量差異均不大。對ITS-1的堿基組成分析結果表明（表1），3種昆蟲的堿基A、G、C、T平均含量分別為34.4%、153%、11.4%和389%，A+T（73.2%）含量明顯高于G+C含量（26.8%）。對ITS2堿基組成分析結果表明（表2），堿基A、G、C、T平均含量分別為33.8%、158%、13.5%和37.0%，A+T（707%）含量明顯高于G+C含量（29.3%）。

2.3 ITS的序列比對分析

將從3種昆蟲中獲得的ITS全長序列在NCBI網站上進行序列的同源性比對分析，結果發現，來自麥紅吸漿蟲的ITS序列與GenBank上來自麥紅吸漿蟲的兩段序列（GAKJ01010562.1，長度為691 bp和GAKJ01010530.1，長度為303 bp）的同源性都為99%。來自菊花癭蚊的ITS-1與來自黑森癭蚊的ITS-1序列（AF488424）同源性為83%。來自麥紅吸漿蟲的ITS-2與來自癭蚊科Endaphis fugitiva的ITS-2序列（HQ599574）同源性為81%;來自食蚜癭蚊的部分ITS-2（330 bp）與來自癭蚊科E.fugitiva的部分ITS-2序列（HQ599574）同源性為84%。將來自3種昆蟲的ITS-1和ITS-2分別進行兩兩序列的同源性比對分析，結果發現序列的同源性均較低（<80%）。

3種昆蟲的ITS序列（ITS-1和ITS-2）比對分析結果顯示（圖1），ITS序列長度上存在較大的差異;

蟲中沒有變化。對3種昆蟲的ITS-1序列進行同源性比對分析，并截取457 bp的同源片段（去掉插入/缺失），其中的變異位點數為146個（31.9%），包括67個轉換位點、71個顛換位點及18個同時發生轉換和顛換的位點。同樣對ITS-2序列進行同源性比對分析，并截取314 bp的同源片段（去掉插入/缺失），其中變異位點數為60個（19.1%），包括29個轉換位點、19個顛換位點及12個同時發生轉換和顛換的位點。

2.4 麥紅吸漿蟲不同地理種群的ITS-1序列分析

以ITS-1F和ITS-1R為引物，從麥紅吸漿蟲的4個地理種群共88個樣品中均能擴增出一條長度約600 bp的單一條帶，序列中包含部分18S rDNA，ITS1和5.8S rDNA。對4個地理種群的ITS-1序列進行比對分析后，截取含有ITS-1的511 bp的對齊序列。序列比對的結果顯示（表3），在麥紅吸漿蟲的4個地理種群中共鑒定出4個變異位點，占所有堿基數的0.78%，其中包括3個簡約信息位點，1個自裔位點，并且其中有2個位點的堿基發生轉換，2個位點的堿基發生顛換。全部序列兩兩之間的同源性高達99%～100%。

經DnaSP分析，在麥紅吸漿蟲4個地理種群中共檢測出7種單倍型。總群體單倍型多樣性指數（haplotype diversity， Hd）為0.654，核苷酸多樣性指數（nucleotide diversity， π）為0.001 8。各種群內ITS-1單倍型數目變化范圍在2～6種不等，平均擁有單倍型4.25種。其中，欒川種群內具有的單倍型種類最多，共檢測到6種單倍型，其次為輝縣種群，檢測到5種單倍型，而從銀川種群檢測出的單倍型數目最少，為2種單倍型。各地理種群ITS-1基因單倍型多樣性為0.311 7～0.796 5，平均為0.607 2，其中銀川種群的單倍型多樣性最低，欒川種群的單倍型多樣性最高。各種群的平均核苷酸多樣性π為0.001 6，在不同種群中π值的變化范圍在0.000 6～0.002 2之間，π值最小的為銀川種群，最大的為欒川種群。

對ITS-1基因的7種單倍型在麥紅吸漿蟲4個地理種群中的分布情況進行分析，結果顯示，hap1和hap3是4個種群的共享單倍型，其中hap1的分布范圍最廣（27.27%～81.82%），在4個種群中共出現45個（51.14%），其次是單倍型hap3共出現23個（26.14%），hap2共出現13個（14.77%），hap4出現2個，hap5出現3個，而hap6和hap7各出現1個。

采用MEGA 5軟件基于大復合概似法（maximum composite likelihood， MCL）模型和Kimura-2-Parameter （K2P）雙參數模型計算種群間遺傳距離（表4）。結果表明，麥紅吸漿蟲4個地理種群間的遺傳距離范圍為0.001 19～0.002 32，平均遺傳距離為0.001 84，其中欒川種群與輝縣種群的遺傳距離最大，為0.002 32;寧夏種群與輝縣種群間的遺傳距離最小，為0.001 19。

3 討論

昆蟲核糖體內轉錄間隔區（ITS）是位于核糖體大小亞基rRNA基因之間的區域，被5.8S rRNA基因分隔為ITS-1和ITS-2片段。通常認為ITS區比rRNA基因有著更高的進化率，種間的序列變異較大，可以為昆蟲種及種以上的分類鑒定提供依據。本研究采用癭蚊科昆蟲ITS序列的通用引物，從麥紅吸漿蟲、菊花癭蚊和食蚜癭蚊3種昆蟲中擴增出全長的ITS序列，其中包括18S rDNA部分序列，58S rDNA，ITS1和ITS2全部序列及28S rDNA部分序列。同時對ITS-1基因片段在麥紅吸漿蟲4個地理種群中的遺傳變異情況進行了分析。

對3種癭蚊科昆蟲核糖體DNA序列的分析結果顯示，3種昆蟲核糖體DNA序列的長度（1 061～1 073 bp）和堿基組成均存在一定的差異。本研究中ITS序列中包括ITS-1（487～535 bp）和ITS-2（336～352 bp）兩個部分。序列比較分析表明，ITS序列中存在206個堿基變異位點，其中包括96個轉換位點，80個顛換位點，30個位點既發生了轉換又發生了顛換，且序列中都存在堿基的插入/缺失。3種昆蟲ITS序列的4種堿基（A、G、C、T）的百分含量都較穩定，并且A+T含量（≥69%）都明顯地高于G+C含量（≤31%），這一結果與鄒志文等[20]的研究結果相一致，即ITS基因序列含有較高的A、T含量。序列的同源性分析結果表明，ITS區（包括ITS-1+ITS-2）在3種昆蟲中的同源性均較低（<80%）。

對ITS-1序列在麥紅吸漿蟲4個地理種群中的變異情況的分析結果表明，共發現4個變異位點，并且序列長度比較保守，沒有發現堿基的插入或缺失。基于ITS-1序列對我國麥紅吸漿蟲4個地理種群間的遺傳關系的分析結果表明，ITS-1序列的單倍型種類和出現頻率在麥紅吸漿蟲4個地理種群中存在很大的差異。但遺傳距離的分析結果顯示，4個地理種群間的遺傳距離較小，表明種群間雖然存在一定程度的遺傳分化，但遺傳分化程度較低。Duan等[21]利用SSR標記和線粒體DNA 標記對麥紅吸漿蟲這4個地理種群的遺傳分化研究表明，這4個種群間存在明顯的遺傳分化。因此，本研究認為ITS-1不適合作為麥紅吸漿蟲種下遺傳分化的分子標記，這與王莉萍等[22]的研究結果表明rDNA-ITS-1序列不適合用于美洲斑潛蠅及其近緣種的種下遺傳分化的分子標記的結果類似。

本研究通過對3種癭蚊科昆蟲核糖體DNA的研究及ITS-1在麥紅吸漿蟲種內的遺傳變異情況分析，初步認為ITS序列在癭蚊科種屬間存在較高的變異，可作為癭蚊科昆蟲系統發育研究及分類鑒定的分子標記;ITS-1序列在麥紅吸漿蟲種內非常保守，遺傳變異較小，不適合作為其種內遺傳分化的分子標記。到目前為止，有關癭蚊科昆蟲rDNA分子標記的研究報道還很少。希望本研究能夠為癭蚊科昆蟲的DNA分子標記開發提供進一步的補充。

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（責任編輯：田 喆）