基于超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)分析普洱生茶和普洱熟茶醇溶性物質(zhì)組成差異

汪生　陳冠軍　臧丹丹　胡江玲　錢成　馮蕊

摘要 [目的]建立了基于超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)方法分析普洱生茶和普洱熟茶中醇溶性差異物質(zhì)。[方法]通過70%甲醇提取和液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析，結(jié)合保留時(shí)間的規(guī)律和數(shù)據(jù)庫匹配鑒定物質(zhì)，依據(jù)正交偏最小二乘法-判別分析表明兩者間物質(zhì)存在顯著差異，結(jié)合模型的變量重要因子和非參數(shù)檢驗(yàn)，篩選差異物質(zhì)。[結(jié)果]普洱生茶和普洱熟茶中共鑒定出100個(gè)化合物。通過統(tǒng)計(jì)分析，2種普洱茶中篩選出32個(gè)差異物質(zhì)，其中氨基酸類、嘌呤類、兒茶素類和沒食子兒茶素類等物質(zhì)在2組中的含量差異顯著。[結(jié)論]建立的方法為合理科學(xué)解釋普洱生茶和普洱熟茶功效提供一定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞 普洱生茶;普洱熟茶;超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜;代謝組學(xué)

中圖分類號(hào) TS 272.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）23-0226-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.059

Non-targeted Metabolomics Study for Differences in Methanol-Soluble Chemical Composition of Raw Pu-er Tea and Ripe Pu-er Tea by Using UPLC-HRMS

WANG Sheng1，2，CHEN Guan-jun1，2，ZANG Dan-dan1，2 et al

（1.The Center for Scientific Research of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032;2.Anhui Province Key Laboratory of Major Autoimmune Diseases，Hefei，Anhui 230032）

Abstract [Objective]To discover the methanol-soluble differential chemical compound in raw Pu-er tea and ripe Pu-er tea by a non-targeted metabolomics method based on UPLC-HRMS.[Method]After the liquid extraction，Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry （UPLC-HRMS） was used for the data acquisition.The chemical identification was carried out by comparing with the known compounds in commercial and public databases.Multivariate analysis，Mann-Whitneg U test and orthogonal projections to latent structures-discrimination analysis （OPLS-DA） analysis were used to find and visualize differential chemical compound.[Result]100 compounds were tentatively identified in raw Pu-er tea and ripe Pu-er tea.Finally，32 compounds，among which，amino acids，purines，catechins，and epigallocins，were a significant difference between them.[Conclusion]This study demonstrates the potentials and power of metabolomics method to understand the chemical secrets of Pu-er tea，which could provide a scientific explanation for the benefit of different Pu-er tea.

Key words Raw Pu-er tea;Ripe Pu-er tea;UPLC-HRMS;Metabolomics

茶是世界上消費(fèi)最廣泛的非酒精性飲料之一，具有巨大的經(jīng)濟(jì)、健康和文化價(jià)值[1]。普洱茶產(chǎn)自中國云南，目前常見的有普洱生茶和普洱熟茶[2-3]。普洱茶在中國有眾多的消費(fèi)者，相關(guān)研究表明，普洱茶具有降血脂、降血糖、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用，因此研究普洱茶中的化學(xué)物質(zhì)及其作用機(jī)制具有很大意義和價(jià)值[2，4-5]。普洱茶是一種獨(dú)特的微生物發(fā)酵茶，目前對(duì)普洱茶的相關(guān)研究報(bào)道很多，主要涉及普洱茶安全性（真菌毒素測(cè)定[6]和農(nóng)藥殘留定量[7]等）、茶葉物質(zhì)組成（靶標(biāo)定量研究[8]和發(fā)酵過程中物質(zhì)變化[9]等）、發(fā)酵過程菌群變化[10-11]以及茶葉的抗炎免疫藥效學(xué)[12]等。

茶葉中的化學(xué)物質(zhì)是構(gòu)成其獨(dú)特風(fēng)味和功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。普洱茶物質(zhì)組成研究主要分為香氣物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)分析兩方面。香氣是普洱茶的重要品質(zhì)特征，相關(guān)研究[13-15]通過氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）發(fā)現(xiàn)普洱茶中的香氣物質(zhì)主要是醇類、酮類、酯類、酸類、醛類、醚類、陳香成分和碳?xì)漕愇镔|(zhì)，為普洱茶的香氣物質(zhì)研究提供了充實(shí)的依據(jù)。普洱茶的獨(dú)特口感和奇特功效也是其廣受歡迎的原因，茶葉中的極性非揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)揮了重要作用。有關(guān)普洱茶中極性物質(zhì)化學(xué)成分的研究很多，大多采用液相色譜（LC）或者與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）的方法。曾亮等[16]通過LC-MS法測(cè)定了不同貯藏時(shí)間普洱生茶水提物的特征性成分，共檢測(cè)到107種化合物;朱洪波等[17]通過純化的方法，從普洱茶水提物中分離鑒定出13種化合物;侯冬巖等[8]測(cè)定普洱生茶與普洱熟茶中原花青素含量;陳紅霞等[9]對(duì)普洱茶渥堆發(fā)酵中活性成分進(jìn)行靶標(biāo)測(cè)定。結(jié)合相關(guān)研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，普洱茶中主要含有兒茶素類、黃酮類、生物堿類等物質(zhì)，同時(shí)還有咖啡因、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等[9，18]。

單變量統(tǒng)計(jì)分析是最簡單常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，常用變異倍數(shù)分析（fold change analysis，F(xiàn)C > 2）和t檢驗(yàn)（P<0.05）在2組樣本之間得到差異化合物，綜合前面2種分析方法可以得到物質(zhì)的火山圖（volcano plot），來尋找潛在的差異物質(zhì)[19]。

綜合VIP值和火山圖（圖5）分析結(jié)果，得到最終的32種差異物質(zhì)，采用聚類熱圖（圖6）對(duì)2種普洱茶中差異物質(zhì)進(jìn)行分析[20]。

研究結(jié)果表明，普洱生茶中含有豐富的氨基酸（茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等）類物質(zhì)、沒食子素類、兒茶素類和槲皮素類等物質(zhì)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[22-23]。在普洱熟茶中，富含嘌呤類（鳥嘌呤、副黃嘌呤和次黃嘌呤）物質(zhì)，研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道相符[9]，從非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究思路，闡明了普洱生茶和普洱熟茶重要的活性物質(zhì)差異。

2.3 普洱生茶和普洱熟茶差異物質(zhì)的代謝通路分析

普洱生茶發(fā)酵制成普洱熟茶，主要是普洱茶渥堆發(fā)酵過程中眾多微生物發(fā)酵所致，主要涉及芽孢桿菌屬、腸球菌屬、青枯菌屬、酵母菌和黑曲霉等[24-26]。通過非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究思路，探究出普洱生茶和普洱熟茶中差異的化學(xué)物質(zhì)，利用MetaboAnalyst的通路分析功能，通過差異代謝物的KEGG ID進(jìn)行通路富集分析。由圖7可知，32種差異代謝物參與的代謝通路有29條。p<0.05且impact>0.2的代謝通路認(rèn)為，相關(guān)性較強(qiáng)的通路共有2條，分別是氨酰tRNA生物合成通路（aminoacyl-tRNA biosynthesis）和丙氨酸-天門冬氨酸-谷氨酸代謝通路（alanine，aspartate and glutamate metabolism）。參與氨酰tRNA生物合成通路和丙氨酸-天門冬氨酸-谷氨酸代謝通路有10種物質(zhì)，分別為天冬酰胺、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酸。以上研究表明，普洱生茶在渥堆發(fā)酵過程中，氨基酸類物質(zhì)被微生物消耗，可能是用于微生物體內(nèi)的氨酰tRNA生物合成，參與微生物的蛋白質(zhì)生物合成。

3 結(jié)論與討論

（1）采用70%甲醇提取普洱生茶和普洱熟茶后進(jìn)行相關(guān)研究，該提取法主要用于提取極性較強(qiáng)的物質(zhì)，不能很好地提取和鑒定弱極性的化合物，結(jié)合GC-MS方法可得到更加全面的物質(zhì)種類信息;限于實(shí)際條件的影響，研究的普洱生茶和普洱熟茶非同一廠家生產(chǎn)。不同的產(chǎn)地、時(shí)間和制作工藝，可能會(huì)導(dǎo)致茶葉本身物質(zhì)含量和種類存在差異;茶氨酸在普洱生茶中含量極高，但是在普洱熟茶中幾乎檢測(cè)不到，有關(guān)機(jī)制尚不明確。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，茶氨酸具有很好的抗氧化、抗腫瘤和保健等功效，有關(guān)普洱茶發(fā)酵過程中茶氨酸的轉(zhuǎn)化機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

（2）采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)合非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究策略，分析了普洱生茶和普洱熟茶中醇溶性差異物質(zhì)種類及其相對(duì)含量。共定性出100種化合物，其中普洱生茶和普洱熟茶中有32種物質(zhì)含量存在顯著差異。2組茶葉中主要含有咖啡因、山萘酚、槲皮素等化學(xué)物質(zhì)，普洱生茶較普洱熟茶中含有豐富的氨基酸類物質(zhì)、沒食子素類、兒茶素類和槲皮素類等物質(zhì);渥堆發(fā)酵得到的普洱熟茶中富含嘌呤類物質(zhì)。通過差異代謝物通路富集分析，普洱熟茶中氨基酸類物質(zhì)顯著減少，可能是氨基酸

在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中參與了微生物的蛋白質(zhì)合成。該研究為科學(xué)合理解釋普洱茶發(fā)酵工藝和茶葉功效提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究普洱茶提供了新的思路和方法。

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作者簡介汪生（1992—），男，安徽銅陵人，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，從事藥物分析學(xué)相關(guān)研究。*通信作者，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事藥學(xué)相關(guān)研究。

收稿日期 2020-05-02;修回日期 2020-06-28