牛血清中6種外源性病毒的液相芯片檢測方法建立

王艷　嚴(yán)敏鳴　黃忠榮　張磊萍　張強　林穎崢　熊煒　李樹清

摘要 為建立牛血清中6種外源性病毒（BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV）的液相芯片檢測方法，根據(jù)6種病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計引物和探針，通過雜交偶聯(lián)檢測，利用Luminex檢測儀檢測熒光信號，建立了牛血清中6種外源性病毒的快速檢測方法。結(jié)果表明，該試驗建立的檢測體系具有良好的特異性和敏感性，其檢測靈敏度可達50拷貝/反應(yīng)。該研究初步建立了同時檢測牛血清中6種外源性病毒的液相芯片檢測方法，為牛血清的質(zhì)量把關(guān)提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 牛血清;外源性病毒;液相芯片

中圖分類號 S 852.5文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）23-0116-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.028

Establishment of Liquichip Detection Method of Six Kinds of Exogenous Viruses in Bovine Serum

WANG Yan1，YAN Min-ming2，HUANG Zhong-rong3 et al

（1. Animal， Plant and Food Inspection and Quarantine Technology Center， Shanghai Customs， Shanghai 200135;2. Animal Disease Prevention and Control Center of Pudong New Area in Shanghai， Shanghai 200120; 3.Shanghai Customs， Shanghai 200135）

Abstract In order to establish the liquichip detection method of 6 kinds of exogenous viruses（BVDV，BPV，BTV，REOV，BPyV，RABV）in bovine serum，on the basis of the specific primers and their corresponding oligonucleotide probes of 6 kinds of viruses were designed， synthesized and modified. Specific probe labeled with biotin was prepared and coupled with fluorescence-coded microspheres. Luminex detector was used to detect fluorescence signal，a quick detection method of 6 kinds of exogenous viruses in? bovine serum was established. The results showed that this assay method displayed good specificity and sensitivity. The sensitivity test indicated the detection sensitivity could reach 50 copies. A liquichip detection method for? six kinds of exogenous viruses in bovine serum was preliminarily established，which provided the technology supports for the quality control of bovine serum.

Key words Bovine serum;Exogenous virus;Liquichip

隨著我國生物醫(yī)藥的發(fā)展，對血清的需求以每年25%的速度增長，對外依存度越來越高。牛血清在疫苗生產(chǎn)中被大量使用，其質(zhì)量直接影響生物制品的質(zhì)量安全，特別是病毒類生物活性物質(zhì)污染會嚴(yán)重影響制品的質(zhì)量安全。日本東京大學(xué)的Harasawa等[1]報道，在5批人用麻風(fēng)腮及風(fēng)疹疫苗成品中檢出了牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）RNA。Brown等[2]報道，由于使用了污染BVDV的胎牛血清，導(dǎo)致了胎牛腎細(xì)胞、牛腎細(xì)胞、牛鼻甲骨細(xì)胞、豬腎細(xì)胞、貓腎細(xì)胞核Vero細(xì)胞等多種細(xì)胞系的污染[3]。

牛腹瀉病毒是疫苗生產(chǎn)中常見的污染物及嚴(yán)重的外源性致病原之一，因此牛血清中BVDV的檢測尤為重要[4]。牛細(xì)小病毒（bovine parvovius， BPV）、藍舌病毒（bluetongue virus， BTV）、呼腸孤病毒（reoviridae， REOV）、牛多瘤病毒（bovine ploymavirus， BPyV）、狂犬病病毒（rabies virus， RABV）也是牛血清中重要的病原外源因子，牛血清的質(zhì)量應(yīng)嚴(yán)格要求[5-7]，由于牛血清質(zhì)量的把關(guān)是生物制品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，原上海檢驗檢疫局曾在進口胎牛血清中檢測出牛病毒性腹瀉病毒[8]，因此建立外源性病毒的快速檢測方法將有助于把控牛血清質(zhì)量，防止外源性病毒的污染。筆者以牛血清中BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV 6種重要外源性病毒為研究對象，建立可以同時檢測的液相芯片檢測方法，并對其靈敏度、特異性等指標(biāo)進行驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉素-親和素（SA-PE）采購自Invitrogen公司;6種不同編號的熒光編碼微球購自Bio-Rad公司;Luminex200為Luminex公司產(chǎn)品;BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV質(zhì)粒由上海海關(guān)動物檢疫實驗室保存，濃度為 500拷貝/μL，保存于-20 ℃下備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 探針及引物的設(shè)計和合成。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫發(fā)布的基因序列，應(yīng)用Primer 5.0序列分析軟件進行序列分析、引物、探針設(shè)計，并分別在5′端和3′端進行修飾（表1）。引物、探針?biāo)椭辽虾Ｉ锕こ逃邢薰煞莨竞铣伞?/p>

1.2.2 單對引物及多重引物的擴增產(chǎn)物電泳檢測。利用設(shè)計的引物對目標(biāo)質(zhì)粒進行單重和多重擴增，以鑒定引物的特異性。PCR反應(yīng)體系：10×buffer（Mg2+） 2.5 μL、dNTP （2.5 mol/L）1.0 μL、引物 1.0 μL、模板 2.0 μL、Taq 0.5 U、ddH2O 18.5 μL，總PCR體系25 μL。多重PCR引物的加入量REOVF/R 1.5 pmol，BPVF/R 2.0 pmol，BTVF/R 3.0 pmol，BVDVF/R 2.0 pmol，BPyVF/R 1.5 pmol，RABVF/R 2.0 pmol。PCR擴增程序如下：95? ℃預(yù)變性 10 min;95? ℃ 30 s，52? ℃ 30 s，72? ℃ 20 s，35個循環(huán);72 ℃再延伸1 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.2.3 微球探針的交聯(lián)。在EP管中加入相應(yīng)的熒光編碼微球100 μL（表2），5 000 r/min離心10 min 后棄上清，并用ddH2O沖洗2次;用100 μL 0.1 mol/L pH 6.0的MES將之懸浮后，加入0.2 nmol/μL探針3 μL，充分混勻后，加入15% EDC，用鋁箔紙包裹EP 管于37 ℃條件下放置30 min;離心吸去上清，用0.1% SDS洗滌2次后，用50 μL TE緩沖液（pH 8.0）重新懸浮后，4? ℃下避光保存，備用[9-10]。

1.2.4 雜交捕獲檢測。取PCR產(chǎn)物5 μL，加入微球溶液25 μL（熒光編碼微球的數(shù)量約80個/μL），充分混合均勻后按照以下步驟進行雜交反應(yīng)：94? ℃變性3? min，50 ℃孵育30? min;隨后加入0.2 μg/μL SA-PE 70 μL，50 ℃孵育20? min，孵育結(jié)束后直接上機讀取信號（試驗須在微球個數(shù)不小于20個且背景空白熒光強度不高于300的情況下才成立）。

1.2.5 探針特異性的檢測。每個反應(yīng)體系25 μL，將6種不同編碼的熒光微球混合，與每一對引物PCR擴增產(chǎn)物進行雜交。

1.2.6 液相芯片檢測體系的建立。取20份其他檢測方法檢測為陰性的樣品進行檢測，計算每種微球平均熒光強度（median fluorescent intensity，MFI）的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的值作為對應(yīng)檢測指標(biāo)的cut-off值，確定閾值，高于cut-off值就視為陽性。

1.2.7 液相芯片檢測體系特異性。將牛腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、藍舌病毒、呼腸孤病毒、牛多瘤病毒、狂犬病毒、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenzavirus 3，BPIV3）、傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、赤羽病病毒（Akabane disease virus， ADV）的DNA作為PCR擴增模板，利用已建立的檢測方法進行雜交檢測。

1.2.8 液相芯片檢測體系靈敏度。將質(zhì)粒BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV進行5、10、50倍稀釋，并分別作為PCR擴增模板，利用已建立的檢測方法進行雜交檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果 擴增結(jié)果表明，該試驗設(shè)計的引物具有良好的特異性（圖1）。

2.2 探針特異性檢測 6種混合微球?qū)我灰飻U增產(chǎn)物的雜交檢測結(jié)果如表3所示。

以上數(shù)據(jù)顯示，混合的6種探針能特異性識別捕獲引物，表明該試驗設(shè)計的探針具有良好的特異性。

2.3 液相芯片檢測體系的建立

20份陰性樣品經(jīng)PCR擴增的產(chǎn)物用于液相芯片檢測方法閾值的確定，計算MFI的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，閾值=42.15+3×10.62=74.01。

2.4 液相芯片檢測體系特異性

特異性檢測結(jié)果表明，建立的液相芯片體系對REOV、BPV、BTV、BVDV、BPyV、RABV產(chǎn)生特異性反應(yīng);與牛血清其他重要病原不產(chǎn)生反應(yīng)，表明建立的液相芯片檢測體系具有良好的特異性（表4）。

2.5 液相芯片檢測體系靈敏度 靈敏度試驗結(jié)果見表5，所建立的檢測體系的靈敏度為50拷貝/反應(yīng)。

3 討論

動物疫苗的主要作用是預(yù)防傳染病。動物疾病傳入某一國家，其最主要的風(fēng)險途徑是通過進口活動物及動物產(chǎn)品，通過疫苗進口傳入疾病則較為少見。但是，由于動物疫苗本身產(chǎn)品的特殊性，在疫苗生產(chǎn)期間若使用的種子毒株、細(xì)胞培養(yǎng)物、動物或動物源性成分被污染，或發(fā)生交叉污染，或疫苗本身滅活工作沒有做好，動物疫苗在生產(chǎn)過程中就會被污染。此類污染疫苗一經(jīng)使用，就會將病原直接傳入動物體內(nèi)。為此，對進口動物疫苗進行病毒安全性研究，為控制其風(fēng)險提供有力保障。該研究利用液相芯片技術(shù)，建立了能特異性檢測BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV 6種病原的液相芯片檢測方法。該檢測方法能夠?qū)δ繕?biāo)基因進行快速檢測，其檢測靈敏度達50拷貝/反應(yīng)，特異性好。

參考文獻

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基金項目 上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研項目（16DZ0501502）。

作者簡介 王艷（1981—），女，江蘇南通人，高級獸醫(yī)師，博士，從事動物檢疫工作。

收稿日期 2020-04-15;修回日期 2020-05-12