新型鴨呼腸孤病毒分離鑒定及σC基因進化分析

申翰欽

摘? 要：新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck orthoreovirus，NDRV）在番鴨和北京鴨上流行，引起番鴨的肝斑狀出血和北京鴨的脾壞死。本研究從廣東云浮某養殖場發生以肝臟出血為病變的番鴨中分離到一株NDRV，命名為GD-YF-202001。對GD-YF-202001株的σC基因進行RT-PCR擴增、克隆測序與序列分析。結果顯示，分離株σC基因與NDRV SDJN18毒株同源性最高，遺傳距離較近;分離株σC氨基酸序出現多個氨基酸位點突變，發生了較大的變異。

關鍵詞：新型鴨呼腸孤病毒;NDRV;分離鑒定;σC基因;進化分析

新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck orthoreovirus，NDRV）屬于呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬成員，基因組由10個雙鏈RNA片段組成。NDRV感染番鴨主要引起肝臟斑狀出血和壞死，感染北京鴨主要引起脾壞死等癥狀[1，2]。NDRV感染能引起免疫器官，因此被認為是鴨群重要的免疫抑制病，發病日齡在5～25 d左右，死亡率為5%～50%，且發病日齡越小，死亡率越高[2，3]。近年來，該病在山東、河南、河北、安徽、遼寧、福建、廣東等地均有發生，嚴重影響養鴨業的發展[4，5]。

本研究于2020年從廣東云浮某養殖場出現典型肝臟斑狀出血癥狀的番鴨病料中分離到一株NDRV，并對σC基因測序及遺傳進化分析，以探究分離株的生物學特性，以期為NDRV流行病學調查積累數據，為該病防控提供參考依據。

1? 材料與方法

1.1? 臨床樣品采集與病毒分離? 發病番鴨群死淘率約20%，病死鴨剖檢可見肝斑狀出血。采集發病鴨只的肝臟和脾臟組織，剪碎，加入5倍量PBS以及2000 IU/mL的青霉素、鏈霉素研磨成糜狀，移入滅菌離心管中，在4 ℃的冰箱中放置3 h后，反復凍融3次，8000 rpm離心5 min，取上清接種Vero細胞和DEF細胞，37 ℃培養3～5 d，待超過50%細胞出現CPE后凍存于-80 ℃備用。

1.2? RT-PCR檢測? 取1.1中收集的細胞上清，按照HiPure Viral RNA/DNA Kit試劑盒說明書提取病毒RNA。使用TaKaRa公司PrimeScriptTM One-Step RT-PCR試劑盒進行σC基因擴增（上游引物：5′- GCATGCAATGGTGGTACAGTG -3′;下游引物：5′- CTTACTGCGTGACATGGACC -3′）[4]，反應條件為：50 ℃ 30 min;94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共進行35個循環;72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖電泳檢測擴增產物，回收目的片段，克隆至pMD19-T載體，轉化至Dh5α感受態細胞，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3? σC基因測序與分析? 用DNAStar軟件對分離株與參考毒株σC基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列進行同源性分析。使用MEGA-7軟件鄰位相接法構建進化樹。

2? 結果

2.1? 病毒分離鑒定? 臨床病料分別接種Vero和DEF細胞，培養3～5 d，細胞出現融合、裂解等典型的CPE，見圖1。細胞上清液RT-PCR檢測結果顯示NDRV陽性。分離毒株命名為GD-YF-202001株。

2.2? σC基因測序與分析? 測序獲得σC基因長966 bp的開放性閱讀框，編碼321個氨基酸殘基。對獲得的序列進行同源性分析，結果顯示分離株與NDRV SDJN18株同源性最高，核苷酸和氨基酸同源性分別為96.3%和96.0%;與NDRV代表毒株TH11和091核苷酸同源性分別為94.1%和95.0%，氨基酸同源性分別為95.3%和95.0%，見表1。

2.3? 氨基酸序列變異分析? GD-YF-202001株σC氨基酸序列發生多個位點的突變，主要在第200（G→D）、207（I→T）、223（M→L）、255（M→L）、289 （S→T）、298（A→V）、300（V→I）、304（S→P）、310（Q→R）位氨基酸，見圖2。這些氨基位點的突變與獨立的相關性需要進一步的研究。

2.3? 遺傳進化分析? 遺傳進化分析結果表明，GD-YF-202001株與NDRV SDJN18株和SDHZYC株遺傳距離較近，但與SDJN18所在的Clade II分支仍有一定的遺傳距離，形成獨立的分支。NDRV代表毒株TH11和091屬于Clade I分支，由進化樹可見，GD-YF-202001株介于Clade I與Clade II之間，見圖3。

3? 討論

NDRV在國內分布廣泛，番鴨、半番和白鴨均易感，能引起較高的死亡率，嚴重威脅我國水禽產業的發展[4]。目前尚未有商品化的疫苗用于該病的預防，做好生物安全措施是防控該病的重要手段，特別是做好孵化場消毒工作，避免鴨群從孵化場感染帶毒。NDRV感染可導致免疫抑制，容易引起細菌性疾病的繼發，且繼發感染后抗生素治療效果較差，造成嚴重的經濟損失。

本研究從廣東云浮某養殖場發生肝臟斑狀出血癥狀的番鴨群中分離到1株NDRV，該毒株感染Vero和DEF細胞引起典型的CPE[6]，在DEF細胞上毒價可達108 TCID50/mL，提示鴨呼腸孤病毒具有廣泛的細胞嗜性。σC基因進化分析發現該毒株處于Clade I和Clade II之間，氨基酸序列發生多個位點突變。這些突變位點位于病毒表面，集中在200～310位氨基酸之間，突變是否與毒力相關還需要進一步研究。

參考文獻：

[1]? 張思遠，盧秀嫻，云驁，等. 新型鴨呼腸孤病毒廣東分離株σC蛋白基因序列分析[J]. 中國獸藥雜志， 2019， 53（12）： 1-6.

[2]? 黃瑜，蘇敬良，施少華，等. 我國鴨呼腸孤病毒感染相關的疫病[J].中國獸醫雜志，2009，45（07）：57-58.

[3]? Wang H， Gao B， Liu X， et al. Pathogenicity of a variant duck orthoreovirus strain in Cherry Valley Ducklings[J]. Veterinary Microbiology， 2020， 242： 108546.

[4]? Cao Y， Sun M， Wang J， et al.Phenotypic and genetic characterisation of an emerging reovirus from Pekin ducks in China[J].Scientific Reports， 2019， 9（1）：478-484.

[5]? Wang H， Gao B， Chen H，et al.Isolation and characterization of a variant duck orthoreovirus causing spleen necrosis in Peking ducks， China[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2019，66（5）：2033-2044.

[6]? 羅丹，高立，孟照潔，等. 新型鴨呼腸孤病毒的分離鑒定及其σC基因遺傳進化分析[J].中國預防獸醫學報，2020，42（05）：445-450.