長雙歧桿菌DD98體內外安全性評價

莊偉清， 李忠磊， 張旭東， 陳代杰， 譚 俊*

1. 上海醫藥工業研究院， 上海 201203； 2. 上海交通大學 藥學院， 上海 200240

益生菌是一種活的微生物，當攝入達到一定量時能夠對宿主起到促進健康的作用[1]，其中大部分是乳酸菌，包括乳桿菌、乳球菌和雙歧桿菌等至少23個屬。近些年來，大量的研究表明益生菌在調節機體免疫系統方面有很多重要的功能，另有研究[2-5]發現益生菌能夠改善腹瀉，改善炎癥性腸病，改善胃腸道功能和抗過敏等。目前益生菌已被應用于發酵乳制品及許多功能性食品中，被認為是有益且安全的，深受消費者的青睞。盡管益生菌受到一致好評，但是潛在的安全問題是不容忽視的[6,7]，隨著益生菌市場規模的不斷擴大，尤其是在食品和醫藥等領域，根據新思界產業研究發布的《2016年—2019年中國乳酸菌市場深度分析報告》顯示，2015年我國乳酸菌市場的規模已經達到 660億元，益生菌的安全性評價變得更加重要[8,9]。

對于將作為益生菌使用的乳酸菌，參照世界衛生組織(WHO)、聯合國糧食及農業組織(FAO)和歐盟制定的益生菌安全性評估指南[10-13]，需從傳統的生理生化檢測、體外致病基因檢測、抗生素抗性實驗和細菌易位實驗、體內致病性檢測等方面判斷其安全性。乳酸菌一般被認為是對人體無害的，但是隨著抗生素藥物的濫用，新型乳酸菌的分離應用和轉基因乳酸菌的出現，乳酸菌的安全性值得關注，特別是投入到實際應用之前。開展乳酸菌菌種安全性評價，是保證最終產品的食用安全，也是保護消費者健康的重要措施[14-16]。因此，本文對具有調節腸道菌群作用的長雙歧桿菌DD98進行安全性評價，包括急性毒性實驗、耐藥性實驗及有害代謝產物等實驗，以確定其安全性，對開發相應益生菌產品具有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)DD98，本實驗室專利菌株。

1.1.2培養基

MRS 培養基：蛋白胨 10.0 g /L，牛肉粉 5.0 g/L，酵母粉 4.0 g /L，葡萄糖 20.0 g /L，吐溫80 1 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g /L，乙酸鈉·3H2O 5.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L， MgSO4·7H2O 0.2 g /L，MnSO4·4H2O 0.05 g /L，瓊脂粉 15.0 g /L，pH 6.2；115 ℃滅菌20 min。

斜面固體培養基：蛋白胨 3.0 g /L，酵母粉 12.5 g /L，葡萄糖 6.0 g /L，氯化鈉 5.0 g /L，無水乙酸鈉 3.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.55 g /L，瓊脂粉 18.0 g /L，pH 6.8，121 ℃滅菌 20 min。種子培養基：即斜面固體培養基去掉瓊脂。

發酵培養基：脫脂奶粉 80.0 g /L，酵母粉 5.0 g /L，碳酸鈉 3.8 g /L，pH 6.8，115 ℃高壓滅菌 20 min。

脫羧酶培養基：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏5.0 g，氯化鈉2.5 g，葡萄糖0.5 g，吐溫80 1 g，MnSO40.5 g，MgSO40.2 g，FeSO40.04 g，硫胺素0.01 g，K2HPO42g，CaCO30.1 g，溴甲酚0.06 g，5-磷酸吡哆醛0.05 g，前體氨基酸5.0 g，加去離子水至1 L，調pH至5.3～5.5，115 ℃滅菌20 min。

硝酸鹽培養基：蛋白胨5.0 g /L，硝酸鉀 1.0 g /L，pH 7.0。購置青島海博生物科技有限公司，產品編號：HB8460。

1.1.3實驗動物

健康雄性 SPF 級 ICR 小鼠，6～8 周齡，質量 18±2 g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供。飼養于上海交通大學實驗動物中心，動物實驗計劃通過上海交通大學實驗動物管理委員會審核。

1.1.4儀器

超低溫冰箱FermoTM900，美國Thermo Scientific；超凈工作臺ZHJH-C1112B，上海智城分析儀器公司；立式高壓滅菌鍋LDZX-75KBS，上海申安醫療器械廠；BIOTECH-7BG發酵系統，上海保興生物設備工程有限公司；酶標儀Multiskan Go，美國Thermo Scientific；CA-500 血液自動分析儀，山東蘭橋醫學科技有限公司； Bio-Rad 熒光定量 PCR 儀，伯樂生命醫學產品有限公司； Nano Drop 紫外分光光度計，Thermo scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1DD98發酵乳制備

將DD98工作種子接種到新鮮斜面上，于37 ℃厭氧培養箱中厭氧培養24 h；將斜面上的菌苔接種至種子培養基中， 37 ℃厭氧培養箱中培養12 h；將種子按照5 %的接種量接入7 L發酵罐(罐內裝6 L發酵乳培養基)，溫度37 ℃，轉速200 r/min，發酵罐通氮氣，發酵過程 pH控制在6.5，待補堿瓶中堿液補完，發酵液 pH 降至5.5時發酵結束，將發酵液灌裝至無菌瓶里保存。

1.2.2發酵乳活菌檢測

采用平皿澆筑法：選擇合適的稀釋度菌液，分別取 1 mL 加到無菌平皿里，然后將室溫的 BBL 瓊脂培養基倒入培養皿中，立即混勻至平板凝固。每個稀釋度涂三個平板，37 ℃倒置厭氧培養 24 h 左右，待菌落長好后，計數并計算出原菌液的活菌數(CFU/mL)：每毫升原菌液活菌數=同一稀釋度 3個平皿菌落平均數×稀釋倍數。

1.2.3抗生素敏感性檢測

采用藥敏紙片擴散法(K-B法)測定DD98對30種抗生素的敏感性，將待測菌液涂布于MRS固體培養基上，待完全被吸收后，將抗生素紙片放置在上面，37 ℃厭氧培養24 h后測定抑菌圈大小，實驗用抗生素標準品由中國食品藥品檢定研究院出品。本實驗委托中國科學院微生物研究所對 DD98菌株進行抗生素敏感檢測。

1.2.4急性毒性實驗

30 只小鼠隨機分為 3 組，每組 10只，一周適應性飼養后，分別灌胃生理鹽水、DD98 發酵乳高劑量組(1×1010CFU/mL)、DD98發酵乳低劑量組(1×108CFU/mL)，灌胃劑量為 0.2 mL/只，每天1次，連續灌胃20 d。每天觀察小鼠的活動狀態，中毒表現，記錄體重變化。各組小鼠解剖腹部后，摘取其臟器(心、肝、脾、肺、腎)，用濾紙吸殘血，稱重，按照公式計算臟器指數[17-19]：臟器指數=各臟器質量(mg)/小鼠體重(g)。整個實驗過程中，相關手術操作均嚴格遵守動物倫理學原則。

1.2.5血常規指標檢測

采用阻抗法，在 CA-500 血液自動分析儀上進行血常規檢測。共檢測 8 種血常規指標，包括白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細胞比容(HCT) 、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)[20, 21]。

1.2.6細菌移位能力評價

HPLC法同時測定蒙藥達烏里芯芭中梓醇和益母草苷的含量 ……………………………………………… 包玉秋等（11）：1542

分析小鼠血和臟器組織(心、肝、脾、肺、腎)的細菌移位情況。將50 μL小鼠血涂布于MRS平板，于37 ℃下分別厭氧及有氧培養48 h，計數平板上的菌落數。取組織樣品，以1 g/mL懸滴于無菌生理鹽水中，勻漿后取100 μL涂布于MRS平板，37℃下分別厭氧及有氧培養48 h，計數平板上的菌落數，有菌落生長即記為陽性。

1.2.7硝酸鹽還原酶實驗

將DD98菌株接種至硝酸鹽培養基中，37 ℃厭氧培養48 h，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液，觀察顏色變化，以不接種菌液的硝酸鹽培養基為空白對照。

1.2.8氨基脫羧酶活性檢測

將DD98菌株活化后，分別接入含0.1 %前體氨基酸(賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸)的脫羧酶培養基和未添加前體氨基酸的脫羧酶培養基中，培養2 d～3 d，觀察培養基顏色及測定培養基pH[22, 23]。

1.2.9數據分析

實驗數據表示為平均值±標準差(mean±SD)，使用 SPSS 21.0 軟件統計分析實驗數據，并進行相應顯著差異分析。

2 結果與分析

2.1 抗生素敏感性實驗

表1 抗生素敏感性實驗結果

通過DD98對30種常見抗生素的藥敏性實驗可知，DD98對大部分抗生素具有敏感性，僅對部分抗生素具有抗性：如氨基糖苷類(慶大霉素、奈替米星、阿米卡星)；喹諾酮類(環丙沙星)及磺胺類(復方新諾明)藥物。

2.2 有害代謝產物實驗

2.2.1硝酸鹽還原酶實驗

硝酸鹽能在硝酸鹽還原酶的作用下還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是一種劇毒物質，在胃酸環境下可與食物中的胺類物質形成強致癌物亞硝胺。因此，硝酸鹽還原酶實驗對菌株的安全性考察非常重要，如果該菌產生硝酸鹽還原酶，在硝酸鹽培養基上生長時會將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，此時滴加碘化鉀溶液，亞硝酸鹽可以從碘化鉀中置換出單質碘，再滴加淀粉溶液時會變藍色[24]。長雙歧桿菌DD98在該實驗時不能使培養基變藍色，為陰性反應，說明該菌不產生硝酸鹽還原酶，可以在實際生產中應用。

2.2.2氨基脫羧酶活性檢測

氨基酸被氨基脫羧酶脫羧后轉化成生物胺，過量的生物胺可引起頭痛、惡心、呼吸困難、高血壓等中毒癥狀，是非常重要的食品安全性問題，因此，氨基脫羧酶活性檢測對菌株的安全性考察非常重要。脫羧酶培養基中，溴甲酚紫的指示范圍是pH 5.2～6.8，pH在5.5時呈黃色，稍大于5.5就會呈現紫色或者紫紅色。氨基酸脫羧后，會使脫羧酶培養基呈堿性，添加溴甲酚紫指示劑，溶液呈黃色為陰性，紫色則為陽性[25]。長雙歧桿菌DD98測定結果為黃色，說明該菌是安全的，可以在實際生產中應用。

2.3 動物實驗

2.3.1口服DD98機型毒性實驗

灌胃結束的20 d內，小鼠活動正常，飲水飲食無異常，皮毛正常，體重隨時間增加，發酵乳組與對照組無顯著性差異，說明灌胃DD98發酵乳不會影響小鼠生長。血常規指標可以反映出試驗菌株在血液中的副作用，表2結果顯示，灌胃DD98發酵乳的小鼠與對照組小鼠的血常規各項指標無顯著性差異(P>0.05)，說明服用DD98發酵乳不會對小鼠產生不良反應。

表2 血常規指標(n=10)

2.3.2細菌移位檢測

益生菌移位可能引發感染，比如菌血癥、敗血癥或心內膜炎等[26]，因此，細菌移位對菌株的安全性考察非常重要。表3結果表明，對照組與試驗組的血和臟器組織(心、肝、脾、肺和腎)經過培養后，培養基上沒有菌落生長，表明長雙歧桿菌DD98沒有從腸道轉移到血和臟器組織，為發生移位現象，說明該菌是安全的，可以在實際生產中應用。

表3 被試菌轉移到血及臟器組織的移位率

3 總結

通過長雙歧桿菌DD98的安全性評價可知：DD98對大部分抗生素具有敏感性；不會產生硝酸鹽還原酶和氨基脫羧酶；口服不同劑量試驗菌發酵乳，小鼠均未發生不良反應，試驗菌未發生血液及臟器組織(心、肝、脾、肺、腎)的移位，綜上，長雙歧桿菌DD98具有較好的安全性，可以在實際生產中應用。