禽流感與雞新城疫血凝抑制試驗操作方法及注意事項

石蓉/廣西柳州市三江侗族自治縣動物疫病預防控制中心 545500

禽流感、雞新城疫均是家禽養殖過程中的常見疫病，一旦發生將會是養殖戶承受較大經濟損失。HA、HI是獸醫實驗室檢測禽類免疫抗體水平、規劃免疫最佳時機的常用手段，目前在基層有較廣泛應用。但人為操作規范性、選用標準準確度、材料標準性等諸多因素還會影響檢測結果。故而，相關人員一定要扎實掌握試驗操作要點及相關注意事項等，力求從根本上保證檢測結果的準確度，為防控家禽疫病提供科學指導。

1 采集與處理血樣

首先，在血清學檢測以及試驗研究階段，采血均是最基礎工作項目，采血工作質量直接關系著能否順利進入試驗過程及結果判斷情況。在采血期間，要求采血人員在加強自身防護基礎上，要嚴格依照相關規程對采血設施做出消毒、干燥處理，無菌采樣。

其次，分離血清階段中，要靜置、傾斜放置試管，將血清析出溫度控制在23℃以上，血樣基本上能在2h中就可以離析出顏色透亮的血清。若檢測到溫度在10℃上下波動時，建議快速把試管安放在37℃培養箱持續2～3h[1]。要求相關人員在送樣期間不能出現劇烈晃動血樣的行為，以防出現溶血情況，待血樣被安全送到實驗室以后，要快速分離血清，針對無法即刻分離的血清要予以冷藏處理，若發現血清樣品有溶血、膠凍等情況，則要堅決棄用。

最后，部分家禽血清雞紅細胞可能會形成非特異性聚集情況，進而誘導了假陽性反應。故而，建議選用待檢血清作為血凝試驗，若觀測到待檢血清形成凝集紅細胞，則提示存有非特異凝集素，建議快速采用雞紅細胞做出吸附處理。方法如下：量取等體積的雞紅細胞與家禽血清充分混合30min，而后提起清液開展HI試驗。判斷試驗結果期間，相關會發現其和原方法會高一個滴度。這提示在HI階段，應依照病毒類型及血清來源等信息，及時采用相應處理方法。

2 相關注意事項

2.1 科學選擇反應板 推薦使用90°有機血凝板，要求在試驗整體結束后，嚴格依照說明書上提出的內容清晰反應板，確保清潔度符合相關規范要求。當下，很多實驗室頻繁采用一次性V型塑料反應板，用過后無需予以洗刷處理。試驗階段，影加強反應板質量的控制，以防存留問題而導致結果偏離。

2.2 合理選用稀釋液 HA、HI試驗階段，為將稀釋液對檢測結果精確度形成的影響降至最低，建議選擇符合pH7.2、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS），其用于以上兩項試驗研究中取得的效果優于生理鹽水[2]。

2.3 加樣階段的注意事項 首先，在取樣環節中，要求移液器只需按至首個檔停點，排樣階段要求按至第2檔停點，方能保證樣品整體排出，從根本上保證取樣量的準確度。其次，吸取液體時，松開拇指的速度要遲緩，過程要平穩，切忌出現過快速放開的操作。與此同時，順沿沿器壁滑出吸頭，以上操作的宗旨是剔除除吸頭外部吸附的多余液體。再者，加樣階段，切忌吸頭與V板孔兩者相觸及，這是減少或規避交叉污染情況的最基礎操作。按照一定比例稀釋樣品過程中，要求操作人員用拇指緩慢按壓、松開移液器按鈕，以防形成數目過多的泡沫，降低移液量的準確度，混合均勻性欠佳，對試驗檢測質量形成負面影響。最后，實際檢測工作中，可能在限定在某時段中要求完成一批次血清多種毒株或亞型檢測的任務，為規避不同抗原液混淆情況，要求一定要對盛放抗原也的加樣槽壁上做出特殊標識。因為一次試驗階段，需要采用數塊反應板設施，也應予以標識。

綜上所述，采用HA、HI試驗檢測禽流感與雞新城疫病毒，多種因素會影響檢測結果的精確度。故而，要求相關人員在試驗活動中，應嚴格控制試驗條件，嚴格依照規范要求配制紅細胞懸液，并合理調控試驗溫度以及時間長度，力爭將各種因素形成的影響降至最低水平。