口蹄疫滅活疫苗生產工藝中新生牛血清的應用進展

張峰宇

（中農威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動物（牛、羊、豬等）一種急性、熱性、高度接觸性和快速遠距離傳播的動物傳染性疾病，FMD被世界動物衛生組織（OIE）列為A類傳染。口蹄疫的發生和流行嚴重影響了社會經濟發展和畜牧業的健康發展，是我國乃至全世界急需控制的重大動物疫病之一。防控口蹄疫的方法有：撲殺、消毒、隔離、強制免疫等，我國采取疫苗免疫和撲殺相結合的綜合措施防控口蹄疫，目前接種疫苗已在防控口蹄疫中占主導地位。

口蹄疫疫苗生產工藝包含：原材料檢驗—培養基配制—種子細胞庫細胞保存和復蘇—種子細胞制備——中毒庫中毒制備（轉瓶、懸浮）——生產用病毒制備——病毒液收集——病毒純化、濃縮——病毒液檢驗——病毒滅活——滅活病毒檢驗——疫苗乳化——疫苗分裝——疫苗包裝——疫苗入成品庫——疫苗成品檢驗——批簽發——銷售出廠。

細胞培養是疫苗生產工藝中不可或缺的重要環節。血清用做細胞培養中最常見的天然培養基，富含蛋白、脂肪酸、白蛋白、球蛋白、纖維粘連素、多肽、激素、胰島素、氨基酸、葡萄糖、酮酸及其他微量元素。

1 材料 儀器

1.1 材料

（1）細胞 BHK21細胞F16代，由中農威特生物科技股份有限公司提供。BHK21細胞是1961年3月，科學家從5只不知道性別的新生1日齡敘利亞倉鼠（又名金黃色倉鼠）腎臟分離培養而成，1964年8月，凍存的原代細胞經45代傳代培養克隆獲得，通過馴化進行懸浮培養，主要用于口蹄疫疫苗和狂犬疫苗的生產。

（2）低血清細胞培養液 由中農威特生物科技股份有限公司提供，其配制及分裝方法參考文獻。

（3）培養基 北京清大天一生物技術有限公司、宜興賽爾生物科技有限公司、甘肅建順生物科技有限公司、

（4）新生牛血清（國內知名生產廠家）：甘肅定西聚信生物工程有限責任公司、內蒙古維克生生物技術股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、蘭州民海生物工程有限公司。

（5）碳酸氫鈉：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司

1.2 儀器設備 小方瓶、三角燒瓶、超凈工作臺、顯微鏡、吸管、移液器、離心機、生物反應器、恒溫水浴箱、恒溫搖床

2 試驗方法

2.1 貼壁細胞培養

2.1.1 單一血清培養

分別將甘肅定西聚信生物工程有限責任公司、內蒙古維克生生物技術股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、蘭州民海生物工程有限公司，四種血清以5%的含量添加至BHK21細胞，在小方瓶中處于相同的培養條件下進行培養傳代，顯微鏡下觀察細胞貼壁、細胞倍增、生長形態、分裂、細胞密度及細胞活力。

實驗結果顯示：不同廠家的新生牛血清在進行BHK21細胞培養工藝中，培養效果都存在一定的差異，細胞活力在74～76%之間，要獲得高密度、高細胞活力的細胞，血清來源的篩選和質量控制至關重要。

2.1.2 混合血清培養

甘肅定西聚信生物工程有限責任公司；天津迪瑞生物科技有限公司；內蒙古維克生生物技術股份有限公司；蘭州民海生物工程有限公司四種血清按相同的比例1.25%混合和按不同比例（總含量5%）混合，在小方瓶中處于相同的培養條件下培養BHK21細胞，顯微鏡下觀察細胞貼壁、細胞倍增、細胞密度及細胞活力。

實驗結果顯示：混合血清培養的細胞倍增明顯提高，細胞活力在90%以上。

研究結果表明：在相同培養條件和環境下，每種單一血清培養的BHK21細胞形態都比較好，形態沒有大的差異，細胞活力75%；而四種混合血清培養的BHK21細胞形態更好，細胞倍增數比單一血清培養更高，細胞活力在90%以上。因此選用優質的混合血清來培養BHK21細胞有優勢。

2.2 懸浮細胞培養

2.2.1 低血清培養

BHK21懸浮細胞是一株廣泛運用于病毒繁殖，生產各種獸用疫苗的細胞，在口蹄疫滅活疫苗生產工藝中，主要采用低血清懸浮培養工藝進行細胞培養和病毒液制備。

在相同的培養條件下，將國內知名廠家甘肅定西聚信生物工程有限責任公司、內蒙古維克生生物技術股份有限公司、天津迪瑞生物科技有限公司、蘭州民海生物工程有限公司，四種不同新生牛血清按不同比例混合后，添加血清含量分別以1%，2%，3%在三角瓶，相同培養條件下在恒溫搖床進行懸浮細胞液培養。

結果顯示：BHK21懸浮細胞在添加含量1%血清進行懸浮培養時生長密度為2.8%左右，細胞活力為88%左右；BHK21懸浮細胞在添加含2%血清進行懸浮培養時生長密度為4.2%左右，細胞活力為98.3%左右；BHK21懸浮細胞在添加含2%血清進行懸浮培養時生長密度為4.4%左右，細胞活力為98.5%左右。

研究表明使用血清含量為2%以上的低血清進行懸浮細胞培養，其細胞密度、細胞活力均優越于使用血清含量為1%的低血清懸浮細胞培養

2.2.2 無血清培養

無血清培養是在天然合成培養基的基礎上，通過添加組分不明確的血清替代物（無血清培養基）進行的細胞培養技術，主要用于生物反應器進行規模化培養。

無血清培養基有無動物來源組分培養基；無動物蛋白培養基；化學組分限定培養基四種。無血清培養基蛋白含量比較高，不利于下游產品的純化；無動物來源蛋白培養基只適用于少數細胞株的培養，基針對性強，一種無血清培養基只能適合某一類細胞的培養具有一定的應用局限性。無血清培養基由于營養不如血清全面，存在潛在的培養細胞所需的某些營養物質的不足；無血清培養基成本高。

研究表明，無血清培養基培養細胞的適用面較窄，不能適用于所有類型細胞的生長增殖，且容易誘發細胞調亡。

3 結論

口蹄疫滅活疫苗生產工藝中，細胞培養方式歷經了帖壁、懸浮，所用血清從單一到混合、血清用量從高濃度血清到低濃度血清，培養基從傳統合成培養基到無血清培養基。在整個發展過程中新生血清依然發揮其不可替代的作用。

血清是作為支撐和維持細胞培養必不可少的重要天然培養基。能為細胞生長提供必需的營養物質氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物、纖維粘連素、胎球蛋白、轉鐵蛋白、多肽、氨基酸、葡萄糖、酮酸及其他微量元素；可為維持細胞指數生長提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺激素、類固醇激素、成纖維生長因子、上皮生長因子、血小板生長因子，促生長激素；血清中的多肽可以促進細胞增殖因子數量的增加和纖維細胞生長因子以及神經細胞生長因子的增加；血清中的促接觸和伸展因子，保護帖壁培養的細胞不受機械損傷。

血清在促進成纖維細胞生長的同時，抑制表皮細胞的生長；血清中的多胺氧化酶與精胺、亞精胺發生多胺反應行動聚精胺，抑制細胞生長。不同廠家、不同批號的血清質量存在很大差異，難以實現實驗操作和生產工藝的標準化；血清的獲取困難、價格昂貴、成本高等特點不適于大規模細胞培養。血清廠家的選擇，質量的穩定性，血清使用量的最佳比例不僅影響細胞培養和病毒液的生產質量，對于控制和降低生產成本，后續純化濃縮效果均有較大影響。

4 展望

口蹄疫滅活疫苗生產工藝中，選用血清為最天然的培養基，需進一步研究出血清明確的組分、產生毒性因素和鏟除的方法、實現血清質量的穩定性、更優化的血清添加比例，使其能適應于規模化、多樣化、自動化的培養技術，降低生產成本，提高細胞培養產率和產物表達率，從而提高疫苗生產質量，生產出具有穩定、安全、均一、有效、經濟性能為一體的優質疫苗產品，促進畜牧業的進一步健康發展。