結(jié)直腸癌納入標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腸道菌群分析的影響△

吳思宇，馬玉芳

武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院腫瘤科，武漢4300640

結(jié)直腸癌是一種多因素疾病，從20 世紀(jì)末開(kāi)始，人們就關(guān)注到腸道菌群是結(jié)直腸癌甚至腺瘤性息肉（adenomatous polyp，AP）的潛在危險(xiǎn)因素，但限于取樣、實(shí)驗(yàn)技術(shù)等各種因素，有關(guān)結(jié)直腸癌致病菌群的研究一度停滯。隨著高通量測(cè)序和分子生物分類(lèi)等方法迅速填補(bǔ)傳統(tǒng)微生物學(xué)技術(shù)存在的空白，以及人類(lèi)腸道微生物群及其相關(guān)代謝譜綜合目錄的建立，21 世紀(jì)初各種相關(guān)試驗(yàn)呈如火如荼之勢(shì)。更令人驚喜的是，腸道主要菌群的檢出和潛在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)為早期檢測(cè)結(jié)直腸癌及尋找治療靶點(diǎn)提供了參考依據(jù)。但由于全世界檢測(cè)結(jié)直腸癌腸道菌群的單個(gè)試驗(yàn)樣本量往往較小，且無(wú)法因研究人群的年齡、地區(qū)、基礎(chǔ)疾病等差異做出相應(yīng)調(diào)整，嚴(yán)重影響了研究者分析腸道菌群的豐度及與結(jié)直腸癌的關(guān)系[1-5]，甚至還出現(xiàn)了研究結(jié)果不一致的現(xiàn)象[6-7]。本研究從以下方面綜合分析結(jié)直腸癌腸道菌群的影響因素：性別、年齡、地區(qū)、飲食習(xí)慣、既往病史、抗生素和益生菌使用情況、檢測(cè)部位、檢測(cè)樣本等，旨在綜合考量混雜因素，厘清納入人選條件，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 性別與年齡因素

研究表明，男性結(jié)直腸癌的發(fā)病率較高，女性則易患近端結(jié)腸腫瘤，且性別不同的結(jié)直腸癌患者的發(fā)病率也會(huì)隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生變化[8]。有研究證實(shí)腸道菌群可以影響人體內(nèi)雌激素水平，進(jìn)而在一定程度上抑制某些惡性腫瘤的發(fā)生[9]。目前有關(guān)結(jié)直腸癌腸道菌群的研究在納入人選時(shí)大多數(shù)已考慮性別對(duì)結(jié)果的影響，且大型薈萃分析可以使男女比例大體相當(dāng)。

年齡與結(jié)直腸癌的發(fā)病率及部位有關(guān)。研究表明，年長(zhǎng)者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)更大[8]。隨著高齡患者對(duì)此病的重視及結(jié)直腸鏡檢查的普及，整個(gè)結(jié)直腸癌群體正在年輕化[10]。大多數(shù)研究的試驗(yàn)組患者（結(jié)直腸癌患者）較健康人群的平均年齡偏大，考慮與結(jié)直腸癌發(fā)病率隨年齡增高有關(guān)。有研究顯示，具核梭形桿菌（Fusobacterium nuclea‐tum）在年齡較大的結(jié)直腸癌患者中具有重要作用，尤其是右側(cè)腫瘤患者[11]。此外，有研究正在調(diào)查年齡對(duì)腸道菌群的影響，以期發(fā)現(xiàn)年輕患者中特定的致癌細(xì)菌[12]。

2 地區(qū)及飲食因素

地區(qū)及飲食是目前臨床試驗(yàn)中涉及較少的因素。飲食方式對(duì)腸道菌群的組成、多樣性和代謝能力均具有重要影響，因此飲食結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)直腸癌腸道菌群研究的納入人選具有較大干擾。大多數(shù)納入研究人群為西方人，其生活方式及飲食習(xí)慣與中國(guó)人群有很大差別。巨單胞菌屬（Megamo‐nas）從未被歐美國(guó)家報(bào)道，但中國(guó)結(jié)直腸癌腸道菌群實(shí)驗(yàn)卻對(duì)其進(jìn)行了關(guān)注[13]。提示針對(duì)西方人群的潛在腸道生物標(biāo)志物可能對(duì)中國(guó)人群并不適用，需要擁有中國(guó)人群腸道菌群的臨床研究。

一項(xiàng)臨床試驗(yàn)將在美國(guó)生活的不同種族人群的腸道菌群和飲食進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)攝入脂肪、蛋白質(zhì)、肉更多的非洲裔美國(guó)人較非西班牙裔白人腸道菌群中存在更多的硫化細(xì)菌[14]。有研究將中國(guó)瑤族人群中的糞便微生物組與生活在同一農(nóng)村地區(qū)的主要少數(shù)民族（壯族）和主要漢族人群的糞便微生物組進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)食用豆類(lèi)較多的瑤族人群的糞便樣本中巨單胞菌屬的相對(duì)豐度最低，擬桿菌屬（Bacteroides）的豐度較高，但隨著飲酒量的增加，普氏菌屬（Prevotella）的豐度減少[13]。這一研究意味著即使在中國(guó)同一地區(qū)，飲食習(xí)慣不同也會(huì)導(dǎo)致腸道菌群存在明顯差異。先前的研究很少涉及非洲和東南亞群體，相關(guān)研究進(jìn)展會(huì)使結(jié)直腸癌腸道菌群信息更完善，數(shù)據(jù)更可靠[5]。

過(guò)濾掉地區(qū)因素后的菌群（如具核梭形桿菌）就是結(jié)直腸癌致病菌群Meta分析尋求的答案[5,11,15-17]，這些菌群將給全世界的結(jié)直腸癌患者帶來(lái)福音，使人們更深入地了解結(jié)直腸癌的微生物學(xué)發(fā)病起因。對(duì)結(jié)直腸癌腸道菌群研究中納入人選的飲食習(xí)慣進(jìn)行較為詳盡的問(wèn)卷調(diào)查，從而分析其對(duì)腸道菌群的影響也是了解地區(qū)因素導(dǎo)致的腸道菌群差異化的方式之一。

3 相關(guān)疾病與結(jié)直腸癌

腸道菌群與疾病之間有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，例如腸道細(xì)菌中大腸桿菌（Escherichia coli）的過(guò)度生長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[18]，惡性黑色素瘤、肺癌人群的免疫治療療效與腸道菌群有關(guān)[19]。有研究提出肥胖與腸道菌群之間可能沒(méi)有關(guān)聯(lián)[20]，而有的研究卻發(fā)現(xiàn)肥胖者與體型正常者的腸道菌群存在顯著差異[21]。炎癥性腸病、2 型糖尿病、過(guò)敏等均與腸道微生物群組成的改變有關(guān)[22]。慢性腸道炎癥疾病，例如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，是由針對(duì)自身共生菌群的過(guò)度免疫反應(yīng)引起的[23]。現(xiàn)有研究在試驗(yàn)后期數(shù)據(jù)處理上開(kāi)發(fā)了區(qū)分糖尿病、炎癥性腸病和結(jié)直腸癌的特異性微生物特征的處理方法[3]，但針對(duì)其他疾病的特異性微生物特征的處理方法還有待進(jìn)一步研究。因此在后期數(shù)據(jù)處理較困難的情況下，盡可能考慮并記錄體重指數(shù)（body mass index，BMI）及納入人選是否患有其他疾病，尤其是對(duì)腸道菌群存在影響的疾病十分必要。

4 是否使用過(guò)抗生素、益生菌、抗腫瘤治療

抗生素已被證實(shí)對(duì)腸道菌群具有影響[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，抗生素組（5 例頭孢類(lèi)及2 例喹諾酮類(lèi)）納入研究人群腸道菌群中難辨梭菌（Clostridium difficile）、遲緩埃格特菌（Eggerthella lenta）、扭鏈瘤胃球菌（Ruminococcus torques）的豐度較未用抗生素組顯著下降[25]。因此，目前大部分病例對(duì)照研究均已考慮抗生素產(chǎn)生的影響，并將其納入了排除標(biāo)準(zhǔn)。

益生菌對(duì)腸道菌群的影響也相繼被發(fā)現(xiàn)[9,26-27]。有研究指出，補(bǔ)充益生菌組納入研究人群糞便中的梭菌（Clostridium）、Dorea 菌（Dorea formicigenerans）、乳酸桿菌（Lactobacillus）的豐度呈數(shù)倍升高[25]。但在了解益生菌對(duì)腸道菌群的顯著影響前，很少有臨床對(duì)照試驗(yàn)[25,28]會(huì)排除入組前1 個(gè)月內(nèi)飲用腸道益生菌、酸奶等乳酸菌制品的腫瘤患者，但也有研究會(huì)在結(jié)腸鏡檢查的前一天，向受試者提供相同的無(wú)乳酸菌制品飲食[29]。因此在未來(lái)的研究中需要考慮益生菌對(duì)研究結(jié)果的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，其他惡性腫瘤（非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌）患者在接受程序性死亡受體1（pro‐grammed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）抑制劑治療后，某些腸道菌群存在顯著變化[19]。有研究將納入研究人群接受化療或免疫治療前后的腸道菌群進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組患者治療后未見(jiàn)菌群變化，然而食管癌、胃癌組患者卻有細(xì)菌豐度變化[25]。上述研究結(jié)果可能與納入研究人群的樣本量較少有關(guān)，抗腫瘤治療對(duì)腸道菌群的影響究竟有多大，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量分析。

5 檢測(cè)部位

研究表明，與遠(yuǎn)端結(jié)腸和直腸相比，近端結(jié)腸中更容易檢測(cè)出具核梭形桿菌[11,15,30]。與左側(cè)結(jié)直腸癌患者相比，右側(cè)結(jié)直腸癌患者中大腸桿菌phylogroup B2 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的發(fā)生率更高[31]。年齡較大的人群（65 歲及以上）中近端結(jié)腸腫瘤最常見(jiàn)，年齡較小的人群（＜50 歲）易患直腸腫瘤，其次是遠(yuǎn)端結(jié)腸癌[8]。腫瘤在左側(cè)或右側(cè)對(duì)患者的整體生存期有影響，且兩側(cè)基因突變的發(fā)生率也存在差異[32]。這些腸道菌群的差異又會(huì)涉及結(jié)直腸鏡腸準(zhǔn)備不同所帶來(lái)的差異。因此所得結(jié)果能否客觀表示腸道菌群的變化還需進(jìn)一步研究。

同時(shí)還要考慮同一結(jié)直腸癌患者的健康黏膜組織和腫瘤組織之間的腸道菌群差異是否可以代表與惡性腫瘤相關(guān)的菌群組成這一問(wèn)題。不止一個(gè)研究將結(jié)直腸癌癌變的黏膜組織與周?chē)】到M織中的腸道菌群進(jìn)行了對(duì)比分析[33-34]。Burns 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中微生物的多樣性增加，具核梭形桿菌和普羅威登斯菌（Providencia）富集。這支持了腸道菌群在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中具有不可或缺的作用，但同時(shí)也提示納入研究人群的取材部位十分重要。那么結(jié)直腸癌患者腸道菌群的改變是否僅局限于腫瘤組織？針對(duì)這點(diǎn)疑惑，解決方式是多點(diǎn)取樣、重復(fù)取樣。

6 結(jié)直腸癌分期

大多數(shù)散發(fā)性結(jié)直腸癌是由息肉、腺瘤一步步進(jìn)展而來(lái)，過(guò)程可長(zhǎng)達(dá)幾十年[35]。納入結(jié)直腸癌患者的臨床分期對(duì)研究結(jié)果具有重要影響。Yachida等[36]研究表明，結(jié)直腸癌患者腸道菌群有兩種物種升高模式，具核梭形桿菌的水平從早期結(jié)直腸黏膜內(nèi)癌至疾病進(jìn)展到晚期一直上升。而極小鏈球菌（Atopobium parvulum）和齲齒放線菌（Actinomy‐ces odontolyticus）僅在疾病早期升高顯著。關(guān)于同一種細(xì)菌，還存在著不同的結(jié)論。有研究指出具核梭形桿菌是惡性腫瘤發(fā)展早期從腺瘤進(jìn)展為癌的危險(xiǎn)因素，甚至在肝轉(zhuǎn)移患者中也扮演著一定角色[37-38]。另有研究提示具核梭形桿菌的豐度在息肉組與正常對(duì)照組間并無(wú)差異，但糞便中具核梭形桿菌的定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）結(jié)合其他生物標(biāo)志物或許可以作為早期檢測(cè)結(jié)直腸癌的非侵入性方式[15]。除了具核梭形桿菌，大腸桿菌強(qiáng)毒株在結(jié)直腸癌的進(jìn)展過(guò)程中同樣具有顯著變化[31]。值得慶幸的是，在意識(shí)到疾病發(fā)展是個(gè)動(dòng)態(tài)演變的過(guò)程后，大量病例對(duì)照研究和隊(duì)列研究開(kāi)始關(guān)注結(jié)直腸癌發(fā)展各個(gè)階段對(duì)腸道菌群的影響。早期及晚期結(jié)直腸癌患者微生物組的變化特征能夠幫助人們更深入地了解結(jié)直腸癌的病因，并為早期診斷提供依據(jù)。

7 檢測(cè)樣本及方法

早前因?yàn)楦鞣N因素，大多數(shù)研究直接將糞便作為檢測(cè)樣本。后來(lái)有研究指出糞便可能包含與疾病部位無(wú)關(guān)的微生物，而活檢僅代表采樣點(diǎn)的微生物，因此糞便會(huì)在檢測(cè)疾病的潛在生物標(biāo)志物中引入“噪音”[29]。在尋求結(jié)直腸癌微生態(tài)紊亂的代表菌群上，腸道黏膜樣品似乎比糞便樣品更適合，糞便樣品不能在豐富度和多樣性上代表與腫瘤黏膜組織相同的微生物群。腸道黏膜管腔界面樣品更適合檢測(cè)某些產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌，例如真桿菌（Eubacterium）和棲糞桿菌（Faecalibacterium），因?yàn)槠涓m合定植在腸道黏膜表面[28]。但近年來(lái)越來(lái)越多的試驗(yàn)表明糞便可以反映結(jié)直腸癌的微生物特征[15-17,37,39]。

腸道菌群分析的準(zhǔn)確性很大程度上取決于所采用的方法，而腸道菌群分析的關(guān)鍵步驟之一是選擇基于16S rRNA的擴(kuò)增子測(cè)序，并評(píng)估其對(duì)腸道菌群分析的影響，但操作存在明顯的技術(shù)差異[40-42]。目前有可將細(xì)菌分類(lèi)鑒定到物種水平的宏基因組全測(cè)序（shotgun metagenomics），但除了難度大、成本高、受限于計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展外，還有分類(lèi)規(guī)則幾乎未獲獨(dú)立研究驗(yàn)證等問(wèn)題[5,43]。除此之外，研究設(shè)計(jì)、樣本收集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存、測(cè)序平臺(tái)的選擇、生物信息學(xué)分析流程不同、缺乏標(biāo)準(zhǔn)比較方案等均會(huì)造成一定程度上的偏倚。因此有文獻(xiàn)將21 種具有代表性的糞便樣品DNA 提取方案按照獲得DNA 的數(shù)量和質(zhì)量進(jìn)行了測(cè)試并排名[4]。如果普及同一種DNA 提取方案，將大幅度改善全球各地腸道菌群研究結(jié)果的可比性。

8 問(wèn)題與展望

結(jié)直腸癌是時(shí)間變化、個(gè)體差異、微生物群演變等多因素導(dǎo)致的，即結(jié)直腸癌可能不只是遺傳疾病，還是微生物疾病。以上這些研究提供的信息對(duì)于以安全的非侵入性方式調(diào)節(jié)大量腸道細(xì)菌、預(yù)防結(jié)直腸癌以及找到靶向微生物的治療藥物至關(guān)重要。雖然許多研究納入的樣本量較小，但眾多提供大數(shù)據(jù)后期處理方法的研究層出不窮，所有薈萃分析都在盡可能考慮混雜因素對(duì)研究結(jié)果的影響，例如糾正批次效應(yīng)[44]、極值分析[6]。隨著各種納入研究人群的相關(guān)信息得到充實(shí)，各種推斷被證明，以及結(jié)直腸癌納入標(biāo)準(zhǔn)的制定，將極大程度簡(jiǎn)化薈萃分析，防止后期分析時(shí)重要物種丟失，為發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者腸道菌群的改變做出貢獻(xiàn)。