一氧化氮在大鼠短暫性局灶性腦缺血損傷中對神經生長因子和腦源性神經營養因子表達的影響

楊 楠 丁 錨 黃語悠 房亞蘭 師文娟 趙詠梅

(首都醫科大學宣武醫院中心實驗室 北京市老年病醫療研究中心，北京 100053)

神經生長因子(nerve growth factor,NGF)和腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)屬于神經營養素家族成員。NGF是神經系統中重要的生物活性分子之一，對神經細胞的存活和生長起重要作用。BDNF是一種廣泛分布于中樞神經系統的神經營養因子[4]，與神經元損傷后再生修復有關。研究[5]顯示，永久性腦缺血后，NGF和BDNF表達上調，但再灌注后NGF和BDNF如何變化卻鮮有報道。缺血半暗帶區是指存在于腦梗死中心部位周圍的缺血但沒有壞死的、處于可逆狀態的腦組織區域，由于血管再通和挽救更多的缺血半暗帶是腦保護藥物研發的一個重要靶點，所以探究再灌注后缺血半暗帶區NGF和BDNF的表達變化十分重要。研究[6-7]顯示，NGF誘導PC12細胞神經突起的生長需要NO的存在，NO可通過cGMP通路誘導背根神經節細胞產生NGF。內源性NO能調控BDNF的產生，同時BDNF也能誘導皮質神經元中NO的產生[8]，說明NO和BDNF可以相互調節。研究[6-8]顯示，NO參與NGF和BDNF等神經營養素家族成員的調控。本研究采用大鼠大腦中動脈梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型即短暫性局灶性腦缺血模型，觀察腦缺血再灌注大鼠在不同時間點NGF和BDNF表達的變化，以及應用NO合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)，對腦缺血大鼠再灌注后NGF、BDNF表達的影響，從而研究在腦缺血再灌注損傷過程中NGF和BDNF表達隨再灌注時間變化的趨勢以及NO對其表達的調控，探討腦缺血損傷的深層機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及處理

健康雄性SD大鼠，體質量280～320 g，北京維通利華實驗動物公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。42只SD大鼠采用數字表法隨機分為7組：假手術(Sham)組；MCAO再灌注0 h(MCAO 0 h)組；MCAO再灌注6 h(MCAO 6 h)組；MCAO再灌注12 h(MCAO 12 h)組；MCAO再灌注24 h(MCAO 24 h)組；MCAO再灌注72 h(MCAO 72 h)組；以及MCAO 24 h+L-NAME組。每組6只大鼠。MCAO術前30 min腹腔注射L-NAME[溶于0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，1 mg/kg]，Sham組和MCAO組大鼠腹腔注射同等體積0.9%(質量分數)氯化鈉注射液。

1.2 儀器及試劑

小動物呼吸機和麻醉機(美國Harvard Apparatus公司)、手術顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)、反饋式溫度調節儀(CMA 150,瑞典Carnegie Medicin公司)、雙極電凝器(DEVEL，ACC100)、冰凍切片機(美國Thermo Fisher Scientific公司)、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。恩氟烷和水合氯醛購自河北一品制藥公司，L-NAME購自美國Sigma公司，3-NT、NGF、BDNF抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 動物模型制作

MCAO大鼠模型的制備依照改良Zea Longa法。先在70%(體積分數)N2O和30%(體積分數)O2中混合5%(體積分數)恩氟烷誘導麻醉，后改用2%(體積分數)恩氟烷維持麻醉。沿大鼠經頸部作正中切口，切開皮膚和皮下組織，分離右側頸總動脈并夾閉，頸外動脈凝斷后，將尼龍線栓自頸外動脈殘端插進頸內動脈，至線栓頂端到達距頸總動脈分叉約1.8～2.0 cm 有阻力感處停止。缺血90 min后，拔出線栓進行再灌注。逐層縫合肌肉、皮膚，再次消毒。術中監測大鼠各項生理參數在正常范圍[9]。

1.4 免疫熒光染色

MCAO組大鼠于再灌注0、6、12、24及72 h，用水合氯醛麻醉，處死取腦，用OCT包埋后，行厚度為20 μm 的連續冰凍切片。用預冷的4%(質量分數)多聚甲醛固定10 min后，用0.2%(體積分數)Triton X-100進行破膜10 min，滴加5%(體積分數)正常山羊血清室溫封閉30 min，棄血清，滴加一抗(NGF抗體做1∶200稀釋，BDNF抗體做1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜。陰性對照不加一抗，用PBS替代。次日將切片用PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300稀釋)，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片劑封片。

1.5 免疫熒光雙標染色

取Sham組、MCAO 24 h組以及MCAO 24 h+L-NAME組大鼠腦組織冰凍切片，于預冷的4%(質量分數)多聚甲醛中固定10 min后，用0.2%(體積分數)TritonX-100破膜10 min，之后滴加5%(體積分數)山羊血清室溫封閉30 min，棄血清，滴加3-NT與NGF抗體(3-NT抗體做1∶300稀釋，NGF抗體做1∶200稀釋)，或3-NT與BDNF抗體(3-NT抗體做1∶300稀釋，BDNF抗體做1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜。陰性對照不加一抗，用PBS替代。次日將切片用PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300稀釋)，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片劑封片。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 腦缺血大鼠再灌注后各時間點缺血半暗帶區NGF和BDNF表達的變化

腦缺血大鼠再灌注后各時間點缺血半暗帶區NGF和BDNF表達，差異有統計學意義(F(2，12)=1119.93，P<0.05)。MCAO再灌注0、6 h組大鼠腦組織幾乎見不到NGF和BDNF陽性細胞。MCAO再灌注12 h組大鼠，腦缺血半暗帶區域可見NGF和BDNF陽性細胞，數量與0、6 h組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。再灌注24 h時，MCAO組大鼠腦缺血半暗帶區NGF和BDNF陽性染色細胞數量較再灌注12 h組進一步增加(P<0.05)；至再灌注72 h，半暗帶區NGF和BDNF陽性染細胞數較再灌注24 h組減少(P<0.05)。腦缺血再灌注可引起NGF和BDNF表達水平上調，再灌注72 h內呈現先升高，再降低的趨勢(圖1A～C)。

圖1 免疫熒光染色法檢測再灌注后各時間點大鼠腦缺血半暗帶區NGF和BDNF的表達Fig.1 Dynamic changes of NGF and BDNF during reperfusion time in cerebral ischemia penumbra of MCAO rats by immunofluorescence stainingA：representative images of NGF-fluorescence staining (red) in MCAO group rats at 0,6,12,24 and 72 h after reperfusion;B:representative images of BDNF-fluorescence staining (green) in MCAO group rats at 0,6,12,24 and 72 h after reperfusion.Bars=20 μm;C：comparison of NGF and BDNF positive cell numbers in MCAO group rats.n=5.*P<0.05 vs 0 h and 6 h group,#P<0.05 vs 12 h group，△P<0.05 vs 24 h group；NGF:nerve growth factor;BDNF:brain derived neurotrophic factor;MCAO:middle cerebral artery occlusion;DAPI:4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.2 腦缺血大鼠半暗帶區NGF和BDNF分別與3-NT共定位

MCAO再灌注24 h組大鼠缺血側半暗帶區內，NGF和BDNF陽性細胞呈綠色，3-NT陽性細胞呈紅色，胞核呈藍色。合并圖像發現，綠色熒光與紅色熒光重合，表明NGF和BDNF分別與3-NT共定位，提示在缺血再灌注后，NGF和BDNF表達量的上調與NO的過量產生相關(圖2A,B)。

圖2 免疫熒光雙標染色法檢測Sham、MCAO 24 h與MCAO 24 h+L-NAME組大鼠腦缺血半暗帶區3-NT與NGF、3-NT與BDNF的表達Fig.2 Expression of 3-NT (red) and NGF (green),3-NT (red) and BDNF (green) in cerebral ischemia penumbra of rats of Sham,MCAO 24 h and MCAO 24 h+L-NAME groups by immunofluorescence double stainingA:representative double immunofluorescence staining showing the colocalization of 3-NT (red) and NGF (green) in the ischemic penumbra of MCAO rats.B:representative double immunofluorescence staining showing the colocalization of 3-NT (red) and BDNF (green) in the ischemic penumbra of MCAO rats.Bars=20 μm;C:quantification of 3-NT and NGF double staining positive cell.n=5.D:quantification of 3-NT and BDNF double staining positive cell.n=5.*P<0.05 vs Sham group,#P<0.05 vs MCAO group;MCAO:middle cerebral artery occlusion;DAPI:4′,6-diamidino-2-phenylindole;L-NAME:Nω-nitro-L-argininic methyl ester;3-NT:3-nitrotyrosine;NGF:nerve growth factor;BDNF:brain derived neurotrophic factor.

2.3 L-NAME抑制腦缺血大鼠半暗帶區NGF的表達

Sham組因沒有缺血半暗帶區，其對應腦區內未見3-NT和NGF雙標陽性細胞，MCAO 24 h組大鼠缺血半暗帶區可見大量的3-NT和NGF雙標陽性細胞；MCAO 24 h+L-NAME組大鼠該區域3-NT和NGF雙標陽性細胞數量比MCAO 24 h組明顯減少(圖2)，組間比較差異有統計學意義(F(2，12)=339.644，P<0.05)。

2.4 L-NAME抑制腦缺血大鼠半暗帶區BDNF的表達

Sham組大鼠未見3-NT和BDNF雙標陽性細胞，MCAO 24 h組大鼠缺血半暗帶區可見大量的3-NT和BDNF雙標陽性細胞；而MCAO 24 h+L-NAME組大鼠該區域3-NT和BDNF雙標陽性細胞數量比MCAO 24 h組明顯減少(圖2)，組間比較差異有統計學意義(F(2，12)= 442.905，P<0.05)。

3 討論

神經營養因子是調節神經系統發育、成熟和維持神經功能的蛋白質。研究[10]顯示，生理狀態下NGF在腦內含量極低。劉鵬等[5]發現，永久性腦缺血模型48 h，大鼠腦內NGF和BDNF 陽性細胞數比假手術組大鼠增加，表明腦缺血本身就能上調NGF和BDNF的表達，但腦缺血再灌注后NGF和BDNF表達如何變化，特別是兩者隨再灌注時程的變化趨勢卻鮮有報道。再灌注引起的血流再通既可使半暗帶腦組織逐漸恢復正常，亦可使腦損傷繼續加劇，造成再灌注損傷，因此，研究具有腦保護作用的NGF和BDNF在再灌注后的表達變化很有意義。本研究中，腦缺血再灌注可引起大鼠腦組織NGF和BDNF表達上升，且在24 h內隨著再灌注時間延長，NGF和BDNF的表達水平遞增，至24 h達到頂峰。由于NGF和BDNF可保護損傷神經元，增強抗凋亡因子表達進而促進細胞存活。因此，大鼠再灌注后24 h內NGF和BDNF表達逐步升高很可能是缺血性腦損傷的一種內源性保護機制，缺血大鼠可能通過NGF和BDNF的代償性增高，來保護大鼠腦缺血半暗帶區內處于休眠狀態或半休眠狀態的神經細胞，使其向正常細胞轉化并恢復神經功能。本研究中，與再灌注24 h組大鼠相比，再灌注72 h組大鼠腦組織NGF和BDNF的表達水平有所下降。研究[11]顯示，神經元是腦缺血損傷后產生BDNF的唯一來源，因此，很可能是由于再灌注72 h時腦組織損傷比再灌注24 h進一步加重，神經元死亡數量也進一步增多，從而導致此時NGF和BDNF的表達水平比再灌注24 h下降。

腦缺血后的神經損傷機制十分復雜，氧化應激是引起腦缺血再灌注損傷的主要因素之一[12]，其中NO在氧化應激損傷中的作用尤為重要。腦缺血再灌注后，NOS表達上調，NO大量產生[13]。本課題組[9]前期研究結果表明，NO的含量在再灌注時升高，至再灌注24 h達到頂峰。抑制NOS活性可以減少腦組織中NO的產生，對大鼠腦缺血再灌注損傷產生保護作用[14]。本研究結果顯示，缺血再灌注24 h大鼠腦內NGF和BDNF表達上調且均與3-NT共定位，提示腦缺血再灌注大鼠腦內NO的過量產生與NGF和BDNF的上調存在關聯。研究[15]顯示，軸突受到損傷后，神經節中NO活性增加，激活神經膠質細胞使其合成NGF增多，而且內源性NO能調控BDNF的產生[8]。因此，可以推測，在缺血再灌注24 h，過量產生的NO促進了腦缺血再灌注損傷，導致NGF和BDNF的表達上調。此時NGF和BDNF表達上調是一種應激性上調，是腦內應對損傷的一種內源性保護。

本研究結果還顯示，MCAO 24 h+L-NAME組大鼠腦內的3-NT和NGF雙標陽性細胞、以及3-NT和BDNF雙標陽性細胞數目均比MCAO 24 h組降低，這很可能是由于L-NAME抑制大鼠腦缺血再灌注后NO的產生，降低了腦缺血大鼠的腦損傷程度，從而使得NGF和BDNF的應激性上調有所恢復。該結果進一步驗證，過量的NO引起的腦缺血再灌注損傷導致了NGF和BDNF表達的應激性上調。

總之，本研究通過研究腦缺血大鼠再灌注72 h內NGF和BDNF表達水平的時程變化，證明在腦缺血再灌注后24 h內NGF和BDNF表達水平持續增加，與腦缺血損傷的內源性保護有關。而再灌注72 h，由于神經元的大量死亡，腦損傷進一步加重，NGF和BDNF表達水平比再灌注24 h下降。本研究還探究了在再灌注損傷過程中，NO與NGF和BDNF之間的關系，證明在腦缺血再灌注24 h內，大量產生的NO引起NGF和BDNF的應激性上調，參與腦缺血損傷的內源性保護。使用NOS抑制劑L-NAME清除NO產生了腦保護作用，NGF和BDNF應激性上調恢復。本研究為進一步探討氧化應激和神經營養因子在腦缺血再灌注損傷中的相互作用提供了科學依據。