H19靶向miR-130-5p調控自然殺傷細胞對前列腺癌細胞的殺傷作用

石濤 高艷 凡磊 周本正 丁志勇 張大虎

(湖北醫藥學院附屬襄陽醫院(襄陽市第一人民醫院) 1泌尿外科，湖北 襄陽 441000；2綜合內科)

前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系統中發病率較高的惡性腫瘤之一，現在的治療方式有手術治療，放射照射及化學治療，內分泌治療等，隨著分子生物學及免疫學的發展，基因治療和免疫治療成為新的治療方法〔1〕。自然殺傷(NK)細胞具有獨立殺傷能力，是腫瘤免疫的第一道防線，且是細胞免疫的主要效應細胞，在PC細胞中低表達，免疫水平下降〔2〕。所以增強機體殺傷癌細胞的能力對PC的發生發展，治療和預后具有重要意義。長鏈非編碼RNA是一類無法編碼蛋白質的RNA，可通過調控miRNA發揮作用，研究發現H19在多腫瘤中異常表達，通過其轉錄產物長鏈非編碼RNAH19影響生長、增殖、分化凋亡及侵襲轉移等過程〔3〕。H19在PC中發揮抑癌基因作用，可作為PC診斷、治療、預后及藥物敏感性的生物標記物〔4〕。但H19對NK細胞的殺傷作用的影響機制目前還不清楚。miRNA是一種內源性的非編碼RNA，同樣具有抑癌或促癌作用，研究發現miR-130-5p在PC細胞中低表達，過表達可抑制PC-3細胞的增殖和遷移，延緩PC的進展〔5〕。但miR-130-5p對NK細胞的殺傷作用的影響機制還尚未清楚，H19是否與miR-130-5p有關也尚未見報道，本文旨在研究H19與miR-130-5p的調控關系及影響NK細胞對PC細胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1材料 NK細胞、PC細胞DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮細胞(RWPE)-1購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI1640培養基、胰蛋白酶購自美國Gibico公司；Lipofectamine TM 2000購自Sigma公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、噻唑藍(MTT)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗體購自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 NK細胞、PC細胞DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮細胞RWPE-1用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，每天換液一次，待細胞融和至80 %左右時，加入胰蛋白酶進行消化傳代，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2細胞轉染與分組 取對數生長期的PC-3細胞和NK細胞，同時接種兩種細胞進行PC-3細胞與NK細胞共培養。將si-NC，si-H19、pcDNA3.1、pcDNA3.1-H19、miR-NC、miR-130-5p、anti-miR-NC、anti-miR-130-5p質粒載體分別轉染至正常培養的PC細胞中；將si-NC，si-H19、miR-NC、miR-130-5p質粒載體分別轉染至PC-3細胞與NK細胞共培養的細胞中；將si-H19分別與anti-miR-NC、anti-miR-130-5p質粒載體共轉染至PC-3細胞與NK細胞共培養的細胞中；以上細胞培養48 h后收集待用。

1.2.3MTT檢測細胞增殖 在各組細胞培養至48 h時加入20 μl(5 g/L)的MTT溶液，繼續孵育4 h；棄去多余培養基并加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞存活率(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。每組重復3次。

1.2.4ELISA法檢測IFN-γ和TNF-α的表達水平 各組細胞，離心取上清，按ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.2.5qRT-PCR檢測miR-130-5p和H19的表達水平 收集各組細胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測定儀檢測RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應體系，以β-actin為內參進行PCR擴增，每個樣品重復3次，循環條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.6Western印跡檢測HLA-G蛋白的表達 收集各組細胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。每個蛋白樣品重復3次。

1.2.7熒光素酶報告基因檢測實驗檢測H19和miR-130-5p及miR-130-5p和HLA-G的靶向調控 TargetScan數據庫顯示H19和HLA-G 3′UTR區域有miR-130-5p結合位點。構建野生型(WT)和突變型(MUT)基因靶點H19和HLA-G的3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-H19、WT-HLA-G、MUT-H19和MUT-HLA-G)，取對數生長期PC-3細胞接種于24孔板(5×104個/孔)，待細胞生長至80 %融合時，用LipofectamineTM2000將WT-H19、WT-HLA-G、MUT-H19和MUT-HLA-G組細胞分別轉染miR-NC和miR-130-5p。依據說明書要求，使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定。實驗結果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統計學分析。實驗重復3次。

1.3統計學分析 采用SPSS20.00軟件行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1H19、miR-130-5p在PC細胞DU-145、PC-3和人正常前列腺上皮細胞RWPE-1中的表達 相較于人正常前列腺上皮細胞RWPE-1，PC細胞DU-145、PC-3中miR-130-5p的表達水平顯著降低；H19的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 H19和miR-130-5p的表達

2.2干擾H19表達的PC-3細胞與NK細胞共培養后對PC-3細胞存活率及對NK細胞產生細胞因子的影響 si-NC組比較，si-H19組PC-3細胞與NK細胞共培養后H19的表達水平顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細胞與NK細胞共培養后對PC-3細胞存活率顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細胞與NK細胞共培養后NK細胞中IFN-γ、TNF-α的表達水平顯著升高(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細胞HLA-G蛋白的表達水顯著降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 抑制H19表達的PC-3細胞與NK細胞共培養后對PC-3細胞存活率及對NK細胞產生細胞因子的影響

圖1 抑制H19對HLA-G蛋白表達的影響

2.3H19靶向調控miR-130-5p的表達 通過TargetScan數據庫預測到H19與miR-130-5p存在結合位點見圖2。轉染野生型H19基因表達載體WT-H19后，與miR-NC組比較，miR-130-5p組WT-H19前列腺癌PC-3細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型H19基因表達載體MUT-H19后，與miR-NC組比較，miR-130-5p組MUT-H19前列腺癌PC-3細胞的熒光素酶活性差異不顯著。見表3。與pcDNA3.1組(0.45±0.04)比較，pcDNA3.1-H19組PC-3細胞中miR-130-5p的表達水平(0.15±0.01)顯著降低；與si-NC組(0.48±0.04)比較，si-H19組PC-3細胞中miR-130-5p的表達水平顯著升高(0.75±0.04，P<0.05)。

圖2 H19和miR-130-5p的互補序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4過表達miR-130-5p的PC-3細胞與NK細胞共培養后對PC-3細胞存活率及對NK細胞產生細胞因子的影響 miR-NC組比較，miR-130-5p組PC-3細胞與NK細胞共培養后miR-130-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-130-5p組PC-3細胞與NK細胞共培養后對PC-3細胞存活率顯著降低(P<0.05)。miR-NC組比較，miR-130-5p組PC-3細胞與NK細胞共培養后NK細胞中IFN-γ、TNF-α的表達水平顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-130-5p組PC-3細胞HLA-G蛋白的表達水顯著降低(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 過表達miR-130-5p對HLA-G蛋白表達的影響

表4 過表達miR-130-5p的PC-3細胞與NK細胞共培養后對PC-3細胞存活率及對NK細胞產生細胞因子的影響

2.5抑制miR-130-5p表達的PC-3細胞與NK細胞共培養后能逆轉干擾H19增強NK細胞對PC-3細胞的殺傷作用 與si-NC組比較，si-H19組PC-3細胞與NK細胞共培養后miR-130-5p的表達水平顯著升高；與si-H19+anti-miR-NC組比較，si-H19+anti-miR-130-5p組PC-3細胞與NK細胞共培養后miR-130-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細胞與NK細胞共培養后對PC-3細胞存活率顯著降低；與si-H19+anti-miR-NC組比較，si-H19+anti-miR-130-5p組PC-3細胞與NK細胞共培養后對PC-3細胞存活率顯著升高(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細胞與NK細胞共培養后NK細胞中IFN-γ、TNF-α的表達水平顯著升高；與si-H19+anti-miR-NC組比較，si-H19+anti-miR-130-5p組PC-3細胞與NK細胞共培養后NK細胞中IFN-γ、TNF-α的表達水平顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較，si-H19組PC-3細胞HLA-G蛋白的表達水顯著降低；與si-H19+anti-miR-NC組比較，si-H19+anti-miR-130-5p組PC-3細胞HLA-G蛋白的表達水顯著升高(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 抑制miR-130-5p表達的PC-3細胞與NK細胞共培養后能逆轉干擾H19增強NK細胞對PC-3細胞的殺傷作用

1～4：si-NC組、si-H19組、si-H19+anti-miR-NC組、si-H19+anti-miR-130-5p組圖4 抑制miR-130-5p表達能逆轉干擾H19對HLA-G蛋白表達的影響

2.6miR-130-5p靶向調控HLA-G的表達 通過TargetScan數據庫預測到HLA-G與miR-130-5p存在結合位點，見圖5。轉染野生型HLA-G基因表達載體WT-HLA-G后，與miR-NC組比較，miR-130-5p組WT-HLA-G前列腺癌PC-3細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型HLA-G基因表達載體MUT-HLA-G后，miR-NC組比較，miR-130-5p組MUT-HLA-G前列腺癌PC-3細胞的熒光素酶活性差異不顯著，見表6。與miR-NC組(0.86±0.04)比較，miR-130-5p組PC-3細胞中HLA-G的表達水平顯著降低(0.51±0.02，P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.89±0.04)比較，anti-miR-130-5p組PC-3細胞中HLA-G的表達水平顯著升高(1.19±0.05，P<0.05)。見圖6。

圖5 HLA-G得3'UTR含有miR-130-5p的互補序列

表6 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組、miR-130-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-130-5p組圖6 HLA-G和miR-130-5p的互補序列及HLA-G蛋白的表達

3 討 論

隨著對PC腫瘤免疫學等研究的深入，靶向免疫治療被認為是PC較有前景的治療方式〔6〕。NK細胞無需特異性抗原就可以直接殺傷靶細胞，可溶解細胞，分泌細胞因子，有強的抵御腫瘤的能力〔7〕。但腫瘤細胞仍能逃避NK細胞的殺傷，因此增強NK細胞抗腫瘤活性和提高NK細胞特異性殺傷力對于腫瘤的治療至關重要〔8〕。研究發現抑制IL-6能增強NK細胞對PC的免疫殺傷能力，抑制了腫瘤的生長〔9〕。硼替佐米能增強PC細胞對NK細胞介導細胞殺傷作用的敏感性〔10〕。而非編碼RNA在免疫細胞活化和功能中也發揮重要作用，長鏈非編碼RNA(LncRNA)AK036396通過Fcnb能夠有效調控粒細胞樣髓源性抑制細胞免疫抑制功能進而影響機體抗腫瘤免疫〔11〕。LncRNA H19在PC中呈現高表達，抑制其表達可有效抑制PC細胞的糖代謝和生長〔12〕。本研究結果也顯示在PC細胞中H19高表達，而且還發現干擾H19表達可以促進NK細胞釋放IFN-γ和TNF-α，抑制與NK細胞共培養的PC-3細胞的存活，即增強NK細胞對PC-3細胞的殺傷作用。

miRNA參與各種免疫細胞的產生、增殖、發育及免疫應答過程中，通過調節相關靶基因的表達發揮著重要的調控作用〔13〕。降低miR-378和miR-30e的表達可增強NK細胞殺傷能力〔14〕。而miR-130-5p對NK細胞的影響未見報道，研究發現miR-130b-5p在腎癌組織和細胞系中高表達，參與腎癌的發生發展相關，可作為腎癌腫瘤標志物〔15〕。miR-130b-5p通過靶向RASAL1促進胃癌細胞的增殖，遷移和侵襲〔16〕。miR-130b過表達可通過增殖阻斷基因和細胞衰老激活的表觀遺傳調控有效誘導PC細胞生長停滯〔17〕。miR-130b通過下調MMP2抑制前列腺癌轉移〔5〕。本研究結果顯示PC細胞中miR-130-5p低表達，過表達miR-130-5p抑制PC-3細胞的存活，即增強NK細胞的殺傷力。

HLA-G屬于非經典的HLA-Ⅰ類分子，一種免疫調節分子，在多種腫瘤中異常表達，參與腫瘤免疫逃逸機制〔18〕。HLA-G能與NK表面受體結合，參與調控NK細胞免疫功能，抑制NK細胞的殺傷作用，調節NK細胞表面受體及細胞因子的表達〔19〕。腫瘤細胞中HLA-G表達可抑制NK細胞的殺傷活性〔20〕。且因HLA-G診斷PC的敏感度和特異度較高，可作為PC的早期篩查和診斷的有效腫瘤標志物〔21〕。研究發現萬珂通過下調HLA-Ⅰ類分子的表達可增強NK細胞對PC的殺傷能力〔22〕。HLA-G多是通過miRNA介導調控發揮作用，研究發現在人絨癌JEG-3細胞中miR-133負性調控HLA-G的表達〔23〕，miR-152也能靶向調控HLA-G的表達〔24〕。LncRNA HOTAIR通過抑制胃癌細胞中的miR-152來促進HLA-G的表達〔25〕。本研究發現H19靶向調控miR-130-5p的表達，而miR-130-5p靶向調控HLA-G的表達，干擾H19表達和過表達miR-130-5p均抑制HLA-G蛋白的表達，說明H19可通過miR-130-5p間接調控HLA-G的表達。