膠原誘導性關節炎發生后不同時間大鼠骨骼的變化

陳文雙 許碧蓮 林長纓 田佳 張新樂

(1廣東醫科大學，廣東 湛江 524023；2廣東醫科大學附屬醫院)

類風濕關節炎(RA)可導致不可逆的關節破壞、畸形，甚至殘疾、死亡。RA在疾病發展和治療過程中容易并發骨質疏松(OP)〔1〕。

OP是以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，致使骨的脆性增加及易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病。RA伴有兩種形式的OP，一種是關節周圍的骨質丟失，另一種是全身性OP。RA的動物模型有多種，其中較為經典的是弗氏完全佐劑(IFA)誘導性關節炎和Ⅱ型膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)大鼠模型，而CIA大鼠模型在病理學上的變化，更接近人類的類風濕關節炎〔2〕。本研究旨在探討CIA發生后不同時間大鼠骨骼的變化。

1 材料和方法

1.1實驗動物 8周齡雌性SD大鼠70只，購自廣東省醫學實驗動物中心，體質量(164±20) g。

1.2藥品及儀器 牛源性Ⅱ型膠原蛋白購自四川大學，IFA購自美國Sigma 公司。viva Micro-CT 40(SCANCO Medical AG，瑞士)，雙能X線骨密度儀(Hologic，Inc，USA)，858 Mini Bionix型材料測試機及測試系統(MTS，美國)。

1.3CIA模型建立及分組〔3〕隨機取24只大鼠作為對照組，46只用于建立CIA模型。暴露大鼠背部皮膚，取配制好的Ⅱ型膠原蛋白乳劑(1.5 g/L)，在脊柱兩旁皮內多點注射，每只注射乳劑0.4 ml。1 w后，加強免疫1次。正常對照組按相同方法注射0.05 mol/L醋酸0.4 ml。自初次免疫3 w后篩選出成功發生關節炎(兩后肢關節炎指數≥4)的大鼠24只為CIA組，然后在CIA發生后4、8、12、16 w隨機處死6只取材。

1.4病理組織學檢查 取右踝關節進行固定、脫鈣、包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色后在顯微鏡下觀察組織病理變化，進行病理學評分統計〔4〕。

1.5Micro-CT測量 將右側股骨沿長軸置于固定器內，使各樣本放置的角度保持一致。采用viva Micro-CT 40對股骨進行掃描，對選定股骨距生長板遠端1.0 mm、層厚3.0 mm的松質骨為興趣測量區域進行圖像分析，得到骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、連接密度(Conn.D.)、結構模型指數(SMI)、體積骨密度(vBMD)等定量參數〔5〕。

1.6骨密度(BMD)及骨生物力學檢測〔6〕將測完micro-CT的右側股骨用雙能X線吸收法(DXA)BMD儀測出骨礦含量(BMC)和骨面積(area)，然后用BMC/area進行計算，即可算出面積骨密度(aBMD)。

將測完BMD的股骨置于(MTS)試驗機上，測試采用三點彎曲法，用1 mm直徑的壓頭，跨距(L)為15 mm，加載速度為0.01 mm/s。儀器即時記錄每個時刻點的載荷和橈度變化值，再進一步換算得每個時刻點的應力和應變值，繪制應力-應變曲線，從曲線上直接獲取或依公式計算出最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷、剛度等參數。

1.7統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析。方差齊時采用LSD 檢驗；方差不齊時采用Tamhane檢驗。

2 結 果

2.1各組踝關節病理學評分的變化比較 與對照組比較，CIA組CIA發生后4、8、12、16 w踝關節病理學評分明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 各組踝關節組織病理學評分的變化分)

2.2各組大鼠股骨骨密度的變化比較 與對照組比較，CIA組CIA發生后4、8、12、16 w股骨aBMD和vBMD均明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組股骨骨密度比較

2.3各組大鼠股骨生物力學參數的變化 與對照組比較，CIA組CIA大鼠發生后4、8、12、16 w股骨生物力學參數最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷、剛度均明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠股骨生物力學參數的變化比較

2.4各組大鼠股骨松質骨Micro-CT定量參數的變化 正常大鼠可見清晰的關節腔，滑膜組織無炎性細胞浸潤，無纖維組織增生，關節軟骨表面光滑，軟骨細胞分布均勻，骨纖維排列整齊。CIA發病大鼠軟骨表面完整性遭破壞，細胞分布不規則；可見軟骨細胞增生，軟骨和滑膜層粘連、纖維化；并有形成肉芽組織和血管翳。與正常對照組比較，CIA大鼠發生后4、8、12、16 w股骨松質骨Micro-CT定量參數BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均減少(P<0.01)，而Tb.Sp、SMI均明顯增大(P<0.01)。見圖1，表4。

圖1 各組大鼠股骨遠端Micro-CT的三維圖

表4 各組大鼠股骨遠端Micro-CT定量參數的變化

3 討 論

通過踝關節組織切片可觀察到：本研究中踝關節組織切片病理改變與RA臨床上出現的關節腫脹，滑膜充血、水腫，組織疏松，滑膜組織的不規則增厚和關節軟骨破壞等基本相似。本研究結果說明CIA大鼠在病理學表現上與人類RA相似，提示本實驗成功建立了CIA大鼠模型。隨著CIA發病時間的延長，大鼠踝關節的病理改變更加明顯。

本實驗采用Micro-CT對股骨遠端松質骨進行三維重建分析，通過Micro-CT直接觀察松質骨的骨小梁形態、結構及三維結構，并獲得骨小梁的立體測量學的指標。Micro-CT比二維體視學定量方法更準確、更科學、更全面反映骨組織結構，能獲得真正的各項同性的容積圖像，提高空間分辨率〔7〕。SMI是用于評價骨小梁的結構形態，反映骨小梁桿狀和板狀的程度，理想板狀結構為0，理想桿狀結構為3，OP時，SMI數值增加，表明骨小梁由板狀轉變為桿狀。Tb.Sp是指骨小梁之間的平均距離，反映骨小梁的結構形態。Tb.Sp越大，表示骨小梁距離越大，OP越明顯。本實驗結果提示隨著CIA發病時間的延長，大鼠股骨松質骨的骨丟失及骨三微結構破壞越嚴重。

BMD的測定可作為OP的診斷、骨折發生的危險性的預測及藥物療效的評價的指標之一〔8〕。BMD有aBMD和vBMD的表達方式。aBMD是利用DXA測出BMC和area，然后BMC除以area得出BMD，也就是常用的BMD。DXA BMD儀測定BMD具有高精度、無創傷、快捷等優點，在臨床上廣泛應用，但是由于骨的厚度沒有得到校正，不能排除骨大小對BMC的影響。因此，有學者認為BMD反映的并不是真正的BMD，僅是一個二維的估計值〔9〕。vBMD是通過Micro-CT對股骨進行三維掃描，獲得骨骼的體積(V)和BMC，BMC除以V即獲得vBMD。vBMD排除了骨大小的影響，更真實反映BMD〔10〕。本研究結果提示CIA大鼠發生后4 w開始出現股骨骨質量下降，骨折發生危險性增加。vBMD的結果變化與踝關節病理學評分、骨量的變化基本一致，說明vBMD比aBMD更真實反映BMD。提示隨著CIA發病時間的延長，大鼠股骨vBMD的降低越明顯。文獻報道，RA病人早期就出現BMD降低，但BMD流失與關節炎的持續性并沒有相關性〔11〕。股骨頸BMD的減小是RA疾病特征之一，股骨頸BMD不僅是一個全身性骨質疏松的指標，也是系統評價RA病人的一個指標，還可以有效衡量RA治療和康復情況〔12〕。

骨生物力學是以工程力學為基礎，研究骨組織在外界作用下的力學特性和骨組織在受力后的生物學效應，是對骨質量進行評定的一種可靠手段。本實驗結果提示CIA發生后4 w大鼠開始出現股骨的生物力學性能降低，骨質量下降，使其在遭受外力的情況下本身的抵抗性能減弱，易于發生骨折。隨著CIA發病時間的延長，大鼠股骨生物力學性能的降低越嚴重。

綜上，CIA發生后4 w大鼠開始出現股骨松質骨的骨量減少，骨三維結構破壞，BMD下降，骨生物力學性能降低，說明CIA發生后4 w大鼠開始出現OP，而且隨著CIA發病時間的延長，大鼠發生的OP越嚴重。臨床研究顯示，68%的RA患者在患病第一年就會出現骨質丟失，骨量的丟失與關節進展性損害相關〔13〕。此外，研究報道，隨著患者年齡、病程及 DAS28 評分增高，患者發生 OP 的風險也增加。隨著RA病程的延長，患者并發OP的發病率明顯高于健康人群，而且OP的病情不斷加重，更容易導致脆性骨折〔14〕。