UNC13D基因剪接突變所致家族性嗜血細胞綜合征1例報告

顏宏利， 王 瑤， 劉明華

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200433

嗜血細胞綜合征，又稱嗜血細胞性淋巴組織細胞增多癥(hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH)，是一種由免疫紊亂所致的嚴重威脅生命的血液系統(tǒng)疾病，其特征為發(fā)熱、肝脾腫大、高三酰甘油血癥、凝血障礙和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。HLH分為原發(fā)性和繼發(fā)性2種類型，原發(fā)性HLH包括家族性HLH (FHL)和遺傳性免疫缺陷相關(guān)HLH，繼發(fā)性HLH常與感染、惡性腫瘤、風(fēng)濕免疫性疾病相關(guān)[1-2]。

FHL是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，由基因穿孔素基因(PRF1，導(dǎo)致FHL2)[3]、UNC13同系物D基因(UNC13D，導(dǎo)致FHL3)[4]、突觸融合蛋白11基因(STX11，導(dǎo)致FHL4)[5]及突觸融合蛋白結(jié)合蛋白2基因(STXBP2，導(dǎo)致FHL5)[6-7]突變引起，多在嬰幼兒期發(fā)病。由于FHL病情兇險、進展迅速，且藥物治療易復(fù)發(fā)，異基因造血干細胞移植是其治愈的唯一方法，所以對癥及時、有效治療十分重要。然而，嬰幼兒在許多疾病中表現(xiàn)為非特異性體征，明確診斷存在一定困難。本文就1例FHL患兒發(fā)病及診斷情況報告如下，并回顧相關(guān)文獻，以供同行參考。

1 病例資料

1.1 一般情況 患兒，女，2月齡，因“發(fā)熱伴面色蒼白4 d”于2015年11月16日收治入院。體格檢查：發(fā)熱，體溫最高達39.7℃，面色稍蒼白，顏面皮膚可見出血點；口腔散在白色凝乳狀物；肝脾肋下約4 cm。患兒哥哥于2013年5月因嗜血細胞綜合征去世。

1.2 實驗室檢查

1.2.1 常規(guī)檢查 血常規(guī)：白細胞4.3×109/L，中性粒細胞絕對值0.47×109/L，血紅蛋白61 g/L，血小板22×109/L。肝功能：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)265 U/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)206 U/L，總膽紅素(TB) 38.6 μmol/L，直接膽紅素(DB) 29.8 μmol/L。三酰甘油(TG)2.43 mmol/L。血漿纖維蛋白原測定：纖維蛋白原(FIB)2.36 g/L；血清鐵蛋白>1 650 μg/L。

1.2.2 骨髓細胞學(xué)檢查 骨髓增生極度活躍，未見嗜血細胞。

1.3 基因分析 經(jīng)患兒家屬同意，留取患兒及其父母靜脈血標(biāo)本行免疫缺陷病基因檢查，采用高通量測序技術(shù)分析其致病基因，Sanger測序方法對所發(fā)現(xiàn)的突變及父母源性進行驗證。

患兒溶酶體轉(zhuǎn)運調(diào)控基因(LYST)4號外顯子檢出雜合突變：c.281C>T(p.Thr94Ile)，經(jīng)家系驗證分析，發(fā)現(xiàn)該變異來自患兒父親。UNC13D基因檢出2個雜合突變：(1)15號外顯子剪接突變(c.1299-1G>A)，該位點可能影響蛋白質(zhì)編碼，但目前尚無相關(guān)文獻確切報道；(2)28號內(nèi)含子剪接突變(c.2709+1G>A)，該突變可導(dǎo)致UNC13D的剪接錯配[8]。經(jīng)家系驗證分析，(1)、(2)變異分別來自患兒父親、母親(圖1A～1D)。

進一步對患兒及其父母與正常人UNC13D基因表達量進行相對定量分析。引物序列如下：上游引物為5′-TCT ACG AGG ACG CAC TCT ACA-3′；下游引物為5′-CCT TGG CCT GTT TCA CTG TTG-3′。結(jié)果(圖1E)發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，患兒及其父母UNC13D基因相對表達量顯著降低。

圖1 UNC13D基因突變家系及基因相對表達量分析

1.4 流式細胞術(shù)分析 抽取患兒外周血標(biāo)本送至北京愛普達檢驗中心，采用流式細胞術(shù)檢測自然殺傷細胞(NK細胞)對轉(zhuǎn)染熒光靶細胞的殺傷活性，采用CD107a激發(fā)實驗檢測NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL細胞)脫顆粒功能。結(jié)果(圖2)顯示，患兒NK細胞活性為13.93%，較參考值(正常參考范圍≥15.11%)降低，說明NK細胞和CTL細胞脫顆粒功能可能存在異常。

1.5 診療經(jīng)過及預(yù)后 患兒入院后予抗感染、補充血小板、輸注紅細胞、丙種球蛋白支持治療；根據(jù)患兒及其父母基因?qū)W檢查，結(jié)合實驗室常規(guī)檢查結(jié)果，對照HLH診斷標(biāo)準(zhǔn)(HLH-2004)[9]，患兒FHL診斷明確，根據(jù)HLH-2004方案[9]進行化療。患兒于2歲半時去世。

2 討 論

FHL是常染色體隱性遺傳病，包括FHL1-FHL5 5個亞型，除FHL1的基因突變未知外，F(xiàn)HL2-FHL5亞型分別與PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2相關(guān)[3-7]。LYST、RAS原癌基因家族成員RAB27A(RAB27A)基因、接頭相關(guān)蛋白復(fù)合物3亞基β1(AP3B1)基因、含SH2結(jié)構(gòu)域蛋白1A(SH2D1A)基因及X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)基因突變與遺傳性免疫缺陷相關(guān)性HLH有關(guān)[10-13]。

圖2 本病例外周血的流式細胞術(shù)分析

現(xiàn)將原發(fā)性HLH分類及突變基因總結(jié)如表1，其中，根據(jù)ClinVar數(shù)據(jù)庫，目前已經(jīng)證實的與FHL相關(guān)的UNC13D突變有300多種。研究[14]表明，雖然FHL亞型的基因突變各不相同，但都會導(dǎo)致NK細胞和T細胞的細胞毒性功能受損。在顆粒介導(dǎo)的細胞毒性途徑中相互關(guān)聯(lián)，干擾穿孔素介導(dǎo)的細胞毒性功能，從而阻斷觸發(fā)凋亡或激活誘導(dǎo)凋亡機制，細胞毒性T細胞和NK細胞不能有效殺死靶細胞，免疫反應(yīng)過度激活、持續(xù)高炎性狀態(tài)，引起HLH癥狀。主要臨床表現(xiàn)：與機體免疫反應(yīng)過度激活相關(guān)的發(fā)熱、貧血、出血、肝脾腫大、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等。由于這些癥狀并非特異性表現(xiàn)，臨床醫(yī)生不一定能在第一時間診斷出HLH。同時，許多患者的相關(guān)臨床表現(xiàn)往往不會同時出現(xiàn)，并不能嚴格達到HLH-2004診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]8項中的5項。因此，對于疑似患者，推薦及早進行基因診斷和NK細胞、CTL細胞功能檢測。

表1 原發(fā)性HLH基因分類及致病途徑

本例患兒為2個月大的女嬰，高熱4 d入院治療。查體發(fā)現(xiàn)脾大，外周血三系減少，AST、ALT、TB、DB水平升高，血清鐵蛋白增加。骨髓檢查排除惡性腫瘤。雖然這些臨床表現(xiàn)與HLH診斷標(biāo)準(zhǔn)(HLH-2004)[9]相符，但非特異，結(jié)合患兒哥哥因HLH去世的情況，因此高度懷疑此其為FHL。

對患兒及其父母進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)2個與HLH相關(guān)的基因存在突變，即LYST基因和UNC13D基因。(1)患兒與其父LYST基因4號外顯子區(qū)域存在c.281C>T，導(dǎo)致編碼的第94位蘇氨酸被異亮氨酸代替，為雜合突變，而其母LYST基因4號外顯子區(qū)域正常無突變，從而，該突變來源于患兒父親；(2)患兒UNC13D基因15號外顯子剪接位點存在c.1299-1G>A(雜合突變)，且UNC13D基因28號內(nèi)含子區(qū)域剪接位點存在c.2709+1G>A(雜合突變)，前者可于其父基因內(nèi)檢測到，后者可于其母基因內(nèi)檢測到，表明患兒UNC13D基因所測得的2個剪接位點突變分別來自其父親和母親。

FHL是常染色體隱性遺傳病，這意味著一般雙等位基因均發(fā)生突變才可致病。本例患兒LYST基因雖存在突變，但2個等位基因中僅存在1個等位基因突變，為雜合突變，且患兒父親也存在該雜合突變且未發(fā)病，考慮由LYST基因引發(fā)疾病的可能性不大。而患兒UNC13D基因存在分別位于2個等位基因上的剪接位點雜合突變，所以推測UNC13D為致病基因，將該患兒歸為FHL3。進一步，根據(jù)患兒及其父母UNC13D基因相對定量檢測結(jié)果進行推測，這是由無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)機制介導(dǎo)的機體識別和降解含有提前終止密碼子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物導(dǎo)致的基因表達量降低，導(dǎo)致蛋白發(fā)生變化而致病。 本文報告突變與近年報道[15]的1例18歲女性FHL患者UNC13D基因突變位點相同，均為2個剪接位點突變，c.1299-1G>A及c.2709+1G>A，父母也分別是c.1299-1G>A和c.2709+1G>A的攜帶者，但是兩者發(fā)病年齡差異較大。NK細胞活性減低或缺失是HLH-2004[9]的8項診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，對臨床篩查有重要價值。CD107a是一種高糖基化蛋白，約占溶酶體膜蛋白的50%，當(dāng)細胞毒性顆粒與細胞質(zhì)膜融合時瞬時在細胞膜上表達[16]。CD107a激發(fā)實驗對于細胞脫顆粒相關(guān)基因(UNC13D、 STX11、STXBP2、RAB27A、LYST及AP3B1)突變的診斷準(zhǔn)確度良好，可用于區(qū)分是否由遺傳因素導(dǎo)致的脫顆粒缺陷，為臨床意義不明的基因突變的解釋提供幫助。本例患兒NK細胞活性檢測及CD107a激發(fā)實驗結(jié)果顯示，其NK細胞活性降低、NK細胞和CTL細胞脫顆粒功能可能存在異常，這與基因檢測結(jié)果相互印證。同時，由于CD107a激發(fā)實驗與基因測序相比，報告結(jié)果更為迅速，且與穿孔素蛋白聯(lián)合檢測和NK細胞毒活性檢測實驗相比有更好的靈敏度和特異度，推薦作為原發(fā)性HLH的篩查實驗[17]。

綜上所述，本研究報告了1例由UNC13D復(fù)雜等位基因突變導(dǎo)致的FHL，為臨床診斷提供參照。近年來，隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，研究[18-20]發(fā)現(xiàn)并報道了許多HLH相關(guān)的新的基因突變，這對于新突變的解釋及致病機制等的研究有重要的臨床意義，同時也為疾病的精準(zhǔn)治療和異基因造血干細胞移植選擇提供了可能。未來希望能夠通過新的技術(shù)手段更好地了解HLH相關(guān)的新的基因突變和病理生理機制，進而快速診斷、精準(zhǔn)治療、降低疾病死亡率、提高患者生存質(zhì)量。