Dectin-1、CARD9基因在角質形成細胞對紅色毛癬菌應答中的作用

陳佳沁?陳劍?鄧威威?蘇真?梁盼盼?湛舒婷

【摘要】目的 研究樹突狀細胞相關性C型凝集素-1（Dectin-1）和胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）基因在角質形成細胞對紅色毛癬菌應答中的作用。方法 將紅色毛癬菌與正常HaCaT細胞、Dectin-1、CARD9基因敲除HaCaT細胞共培養，用ELISA分析其細胞上清液中IL-6、? IL-8的表達情況。結果 Dectin-1基因敲除導致HaCaT細胞IL-6和IL-8基礎分泌明顯增加，敲除CARD9基因導致HaCaT細胞IL-6基礎分泌增加（P < 0.05）。在紅色毛癬菌的刺激下，和未感染相比，HaCaT細胞分泌的IL-8明顯減少（P < 0.05）;Dectin-1基因敲除的HaCaT細胞則表現為IL-6、IL-8分泌量明顯減少（P均< 0.05）;CARD9基因敲除的HaCaT細胞的IL-6、IL-8分泌則無明顯變化（P均> 0.05）。結論 Dectin-1基因和CARD9基因可能參與了維持表皮免疫穩態，CARD9基因還可能介導了紅色毛癬菌引起的免疫應答。

【關鍵詞】紅色毛癬菌;HaCaT細胞;樹突狀細胞相關性C型凝集素-1;

胱天蛋白酶募集域蛋白9

The roles of Dectin-1 and CARD9 genes in the response of HaCaT cells against Trichophyton rubrum Chen Jiaqin， Chen Jian， Deng Weiwei， Su Zhen， Liang Panpan， Zhan Shuting. Department of Dermatology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Chen Jian， E-mail： chj75_0@ 163. com

【Abstract】Objective To investigate the roles of Dectin-1 and caspase recruitment domain-containing protein9 （CARD9） genes in the response of HaCaT cells against Trichophyton rubrum. Methods In this experiment， Trichophyton rubrum was co-cultured with HaCaT cells， Dectin-1-/- HaCaT cells and CARD9-/- HaCaT cells， respectively. The expression levels of IL-6 and IL-8 in the cell supernatant were assessed by ELISA. Results Dectin-1 gene knockout resulted in a significant increase in the secretion of IL-6 and IL-8（both P < 0.05）， CARD9 gene knockout increased the secretion of IL-6 in HaCaT cells（P < 0.05）. After the infection of Trichophyton rubrum， the secretion of IL-8 was significantly decreased in HaCaT cells（P < 0.05）. Dectin-1-/- HaCaT cells showed a significant decrease of IL-6 and IL-8（both P < 0.05）， whereas no evident change was observed in the secretion of IL-6 and IL-8 in CARD9-/- HaCaT cells（both P > 0.05）.Conclusions Dectin-1 and CARD9 genes may play an important role in maintaining the immune homeostasis of the epidermis. CARD9 gene may be involved in mediating the immune response against Trichophyton rubrum.

【Key words】Trichophyton rubrum;HaCaT cell;Dectin-1;

Caspase recruitment domain-containing protein9

皮膚癬菌病是一種全球范圍內常見的疾病，紅色毛癬菌為主要致病菌[1-3]。通常為淺部真菌感染，僅累及表皮及附屬器[4]。在免疫低下患者皮膚癬菌病也可表現為深部真菌感染疾病。致病菌侵入宿主的真皮和皮下組織，進而播散到淋巴結和腦，甚至會危及患者生命[5-6]。

研究者發現樹突狀細胞相關性C型凝集素-1（Dectin-1）和胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）基因的突變和缺失會損害機體對真菌的抗感染免疫[7-10]。提示這兩個基因在皮膚癬菌病致病機制中存在十分重要的作用。HaCaT細胞是人類永生化表皮細胞，與正常人類角質形成細胞分化特性相似。本研究通過分別將紅色毛癬菌與正常的HaCaT細胞、敲除了Dectin-1基因的HaCaT細胞、敲除了CARD9基因的HaCaT細胞共培養，檢測共培養前后炎癥相關因子變化，探討Dectin-1和CARD9基因在角質形成細胞對紅色毛癬菌應答中的作用。

材料與方法

一、實驗材料

1. HaCaT細胞

正常HaCaT細胞購買于賽百慷（上海）生物技術股份有限公司，分離自1例62歲患有黑色素瘤男性的正常外周皮膚。Dectin-1和CARD9基因敲除HaCaT（Dectin-1 ko和CARD9 ko）由課題組參照文獻[11]通過CRISPR-Cas9技術敲除Dectin-1和CARD9基因構建，并經過蛋白驗證和兩基因驗證保存于液氮中。

2. 皮膚癬菌

紅色毛癬菌T1a從中國普通微生物菌種保藏管理中心獲得，并經形態學鑒定以及內部轉錄間隔區和rRNA大亞基的D1-D2結構域測序確認。

二、主要試劑與儀器

DMEM培養基、TRIZOL試劑購自賽默飛世爾公司;沙保羅氏瓊脂培養基購自江門市凱琳貿易有限公司;ELISA試劑盒購于聯科生物;酶標儀（EON267603）。

三、方 法

1. 細胞培養

HaCaT細胞用含有10%胎牛血清和1%雙抗的高糖改良伊格爾培養基培養至長滿細胞瓶，以每孔5×105個細胞接種于六孔板中，培養過夜。

2. 真菌孢子收集

將紅色毛癬菌在沙保羅瓊脂培養基中傳代培養14 d后，加磷酸鹽緩沖液用接種環刮取真菌孢子，微旋振蕩儀震蕩2 min后，11 μm過濾器過濾，2 ml磷酸鹽緩沖液洗滌（3000 轉/分，15 min） 2次。最后用2 ml酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（20%蛋白胨、10%酵母提取物、2%葡萄糖）置于37℃恒溫水浴鍋過夜培養。

3. 細胞與真菌孢子共培養

以感染復數為2將真菌孢子懸浮滴入細胞，置于細胞培養箱（37℃，5% CO2）培養24 h。

4. ELISA檢測細胞因子IL-6、IL-8

提取培養24 h后細胞上清液，用ELISA試劑盒（IL-6、IL-8）按照試劑盒說明書進行操作。分別對紅色毛癬菌感染前后的HaCaT細胞、CARD9 ko和Dectin1 ko上清液進行測定并用細胞用酶標儀檢測。

將3次獨立重復實驗數據進行統計分析。

四、統計學處理

采用GraphPad Prism 7.04和SPSS 24.0進行數據分析。計量數據以表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnet-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、Dectin-1基因和CARD9基因敲除細胞驗證

對基因敲除細胞進行蛋白免疫印跡法驗證，以復孔數目為2進行凝膠電泳跑膠，可以清晰地看到Dectin-1 ko、CARD9 ko與HaCaT細胞相比，實驗孔目的條帶缺失，對照孔（WT）條帶明顯，見圖1。進一步以β-actin為內參抗體，可以發現實驗孔與對照孔內參位置的條帶都十分清晰。結果表明目的基因已被成功敲除，即基因敲除細胞構建成功，可以用于后續實驗。

二、 Dectin-1基因和CARD9基因敲除前后HaCaT細胞上清液中IL-6、IL-8表達情況

敲除了Dectin-1基因的HaCaT細胞IL-6（Dunnet-t = 9.607）和IL-8（Dunnet-t = 3.962）的分泌量均高于正常的HaCaT細胞（P均< 0.05）;而敲除了CARD9基因的HaCaT細胞相比于正常的HaCaT細胞，IL-6分泌量增加（Dunnet-t = 2.924），IL-8分泌量有增加趨勢但比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖2（IL-6：F = 34.76，P < 0.001;IL-8：F = 7.344，P = 0.006）。

三、紅色毛癬菌感染前后HaCaT細胞上清中IL-6、IL-8表達情況

和未感染紅色毛癬菌的HaCaT細胞相比，正常的HaCaT細胞在紅色毛癬菌的感染下IL-8分泌量減少（t = 2.921，P < 0.05），IL-6有減少趨勢但比較差異無統計學意義（P > 0.05）;Dectin-1敲除的HaCaT細胞在紅色毛癬菌的感染下IL-6（t = 9.134）和IL-8（t = 5.611）分泌量均減少（P均< 0.05）;而將紅色毛癬菌與CARD9基因敲除的HaCaT細胞共培養后IL-6、 IL-8的分泌量則無明顯改變（P均> 0.05），見圖3。

討論

角質形成細胞是表皮最主要的構成細胞，其表面的模式識別受體可以識別微生物的病原相關分子模式，誘導產生相應的固有免疫信號，對抵御微生物皮膚感染有重要的作用[12-14]。然而皮膚表面有大量的正常菌群寄生，因此相關的固有免疫必須維持一個合適的強度，以維持表皮的免疫穩態。我們的研究表明敲除Dectin-1和CARD9影響到了角質形成細胞IL-6和IL-8的基礎分泌，這表明Dectin-1、CARD9信號通路對于參與維持表皮的免疫穩態有重要的作用。

紅色毛癬菌是最主要的親人性皮膚癬菌，和親動物性、親土性皮膚癬菌相比，紅色毛癬菌感染所導致的皮損炎癥輕微，感染更傾向于慢性[15]。我們的實驗顯示角質形成細胞被感染后，前炎癥因子IL-6和中性粒細胞趨化因子IL-8的分泌都有降低趨勢。這表明角質形成細胞識別紅色毛癬菌后產生的一些信號，可以抑制IL-6和IL-8的分泌。這可能是其感染炎癥反應輕微的重要機制。進一步研究發現，敲除Dectin-1并沒有改變這一趨勢，和沒有感染的陰性對照相比，Dectin-1敲除的HaCaT細胞，在紅色毛癬菌感染下IL-6、IL-8仍是降低趨勢。這表明角質形成細胞并非通過Dectin-1來感受紅色毛癬菌的感染，進而下調IL-6和IL-8的表達。而敲除CARD9后，紅色毛癬菌感染不能誘導角質形成細胞下調IL-6、IL-8。因此我們推測角質形成細胞通過某一受體，識別紅色毛癬菌，產生的信號經由CARD9介導，最終抑制IL-6和IL-8 的表達。

Dectin-1受體是一個胞外 C 型凝集素樣跨膜受體，可識別真菌細胞壁碳水化合物中的β-（1，3） -葡聚糖[16]。在髓樣細胞中，Dectin-1一般通過識別配體觸發細胞中多種信號導致細胞內脾絡氨酸激酶（Syk）富集，作用于CBM復合體誘導激活NF-κB信號通路[17-18]。CARD9屬于CARD家族中的一員，是Dectin-1以及Dectin-2、Dectin-3等其它C型凝集素樣受體下游通路中的一個重要銜接蛋白，在抗真菌免疫中發揮重要作用[19-21]。我們的研究提示CARD9介導了紅色毛癬菌感染誘導的IL-6、IL-8下調，而Dectin-1并未參與這一過程。CARD9可能是接受了其它可以識別紅色毛癬菌的受體產生的信號，如Dectin-2、mincle等并進一步向下游傳導[22-23]。

我們通過紅色毛癬菌和永生化的角質形成細胞共培養開展體外研究，尚不能完全明確Dectin-1和CARD9基因對紅色毛癬菌感染臨床表現和轉歸的影響。仍需要進行動物感染模型研究，或對先天性Dectin-1和CARD9缺陷并伴有紅色毛癬菌感染的患者開展臨床研究以明確其作用。

綜上所述，Dectin-1基因和CARD9基因可能參與了維持表皮免疫穩態，CARD9基因還可能介導了紅色毛癬菌引起的免疫應答。

參 考 文 獻

[1] 劉蘭. 皮膚癬菌病進展研究. 醫藥衛生（文摘版）， 2016， 2（9）： 306.

[2] 劉楠. 天津地區甲真菌病致病菌的流行趨勢及病甲形態與致病菌的關系研究. 天津醫科大學，2014.

[3] 鄧威威， 梁盼盼， 蘇真， 龔子鑒， 陳劍. 人角質形成細胞應對紅色毛癬菌感染的差異表達基因. 新醫學， 2019，50（2）：93-97.

[4] Silva-Rocha WP， de Azevedo MF， Chaves GM. Epidemiology and fungal species distribution of superficial mycoses in Northeast Brazil. J Mycol Med，2017，27（1）：57-64.

[5] Khaled JM， Golah HA， Khalel AS， Alharbi NS， Mothana RA. Dermatophyte and non dermatophyte fungi in Riyadh City， Saudi Arabia. Saudi J Biol Sci，2015，22（5）：604-609.

[6] 李春云，遲城，陰赪宏. 侵襲性真菌病的治療. 中國醫刊，2017，52（4）：10-13.

[7] Vautier S， Sousa Mda G， Brown GD. C-type lectins， fungi and Th17 responses. Cytokine Growth Factor Rev，2010，21（6）：405-412.

[8] Marakalala MJ， Kerrigan AM， Brown GD. Dectin-1： a role in antifungal defense and consequences of genetic polymorphisms in humans. Mamm Genome，2011，22（1-2）：55-65.

[9] Drummond RA， Franco LM， Lionakis MS. Human CARD9： a critical molecule of fungal immune surveillance. Front Immunol，2018，9：1836.

[10] 張逸， 王曉雯， 李若瑜. CARD9突變在真菌感染性疾病中的研究進展. 微生物與感染， 2018， 13（4）： 233-244.

[11] Ran FA， Hsu PD， Wright J， Agarwala V， Scott DA， Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc，2013，8（11）：2281-2308.

[12] Pivarcsi A， Kemény L， Dobozy A. Innate immune functions of the keratinocytes. A review. Acta Microbiol Immunol Hung，2004，51（3）：303-310.

[13] Sanford JA， Gallo RL. Functions of the skin microbiota in health and disease. Semin Immunol，2013，25（5）：370-377.

[14] de Koning HD， Simon A， Zeeuwen PL， Schalkwijk J. Pattern recognition receptors in infectious skin diseases. Microbes Infect，2012，14（11）：881-893.

[15] Jennings MB， Weinberg JM， Koestenblatt EK， Lesczczynski C. Study of clinically suspected onychomycosis in a podiatric population. J Am Podiatr Med Assoc，2002，92（6）：327-330.

[16] Brown GD. Dectin-1： a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol，2006，6（1）：33-43.

[17] Tsoni SV， Brown GD. beta-Glucans and dectin-1. Ann N Y Acad Sci，2008，1143：45-60.

[18] 孫禾， 徐小勇， 蘇欣，施毅. Dectin-1和Dectin-2在抗真菌免疫中的作用. 國際呼吸雜志， 2013， 33（3）： 226-231.

[19] Roth S， Ruland J. Caspase recruitment domain-containing protein 9 signaling in innate immunity and inflammation. Trends Immunol，2013，34（6）：243-250.

[20] Xu X， Xu JF， Zheng G， Lu HW， Duan JL， Rui W， Guan JH， Cheng LQ， Yang DD， Wang MC， Lv QZ， Li JX， Zhao X， Chen CX， Shi P， Jia XM， Lin X. CARD9S12N facilitates the production of IL-5 by alveolar macrophages for the induction of type 2 immune responses. Nat Immunol，2018，19（6）：547-560.

[21] Bertin J， Guo Y， Wang L， Srinivasula SM， Jacobson MD， Poyet JL， Merriam S， Du MQ， Dyer MJ， Robison KE， DiStefano PS， Alnemri ES. CARD9 is a novel caspase recruitment domain-containing protein that interacts with BCL10/CLAP and activates NF-kappa B. J Biol Chem，2000，275（52）：41082-41086.

[22] Saijo S， Ikeda S， Yamabe K， Kakuta S， Ishigame H， Akitsu A， Fujikado N， Kusaka T， Kubo S， Chung SH， Komatsu R， Miura N， Adachi Y， Ohno N， Shibuya K， Yamamoto N， Kawakami K， Yamasaki S， Saito T， Akira S， Iwakura Y. Dectin-2 recognition of alpha-mannans and induction of Th17 cell differentiation is essential for host defense against Candida albicans. Immunity，2010，32（5）：681-691.

[23] Graham LM， Brown GD. The Dectin-2 family of C-type lectins in immunity and homeostasis. Cytokine，2009，48（1-2）：148-155.

（收稿日期：2020-06-12）

（本文編輯：楊江瑜）