牛膝干預腎虛血瘀型多囊卵巢綜合征的成分靶點和通路分析

袁仁智 唐鵬 雍志強

摘要 目的：運用網絡藥理學方法和技術研究牛膝治療多囊卵巢綜合征（PCOS）的主要活性成分、靶點、通路等藥理學作用機制。方法：通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）篩選出牛膝的活性成分和潛在靶點;查詢NCBI數據庫獲得PCOS疾病靶點，找到藥物和疾病的共靶點;通過DAVID數據庫對共靶點進行基因功能GO富集分析和KEGG富集分析;采用Cytoscape軟件構建成分-靶標-通路網絡。結果：篩選得到有靶點的牛膝候選活性化合物共24個，作用于128個靶點;與PCOS的22個共靶點主要涉及AGE-RAGE信號通路、核因子-κB信號通路、TNF信號通路等;共靶點涉及化合物23個，7個靶點涉及5個及以上化合物，ESR1和AR涉及化合物多達19個，還有GSK3B（12個）、ESR2（11個）、PPARG（11個）、ADRB2（9個）涉及較多化合物。結論：牛膝治療PCOS具有多成分、多靶點協同作用的特點，通過干預分子網絡、生物過程和信號通路來發揮抗炎、抗腫瘤、調節血脂、促進微循環及改善胰島素抵抗的作用。

關鍵詞 牛膝;多囊卵巢綜合征;腎虛血瘀;網絡藥理學;成分;靶點;通路;富集分析

Abstract Objective：To study the pharmacological mechanism of Achyranthes bidentata in the treatment of polycystic ovary syndrome（PCOS）by network pharmacological methods and techniques.Methods：The active components and potential targets of Achyranthes bidentata were screened by the platform of systematic pharmacological analysis of traditional Chinese medicine（TCMSP）; the PCOS disease targets were obtained by querying the NCBI database to find the co-target of drugs and diseases; the gene function GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis were carried out by DAVID database on the co-target database; and the component-target-pathway network was constructed by Cytoscape software.Results：A total of 24 bull knee candidate active compounds were screened，and 128 targets were selected.The 22 common targets with PCOS mainly involved the AGE-RAGE signal path，NF-κB signal path，TNF signal path，etc.A total of 23 target involved in compounds，7 targets involved 5 or more compounds，ESR1 and AR involved as many as 19 compounds，as well as GSK3B（12），ESR2（11），PPARG（11），ADRB2（9）or more compounds.Conclusion：Achyranthes bidentata in the treatment PCOS has the characteristics of multi-component and multi-target synergistic effects.It can play the role of anti-inflammatory，anti-tumor，regulating blood lipid，promoting microcirculation and improving insulin resistance by interfering with molecular network，biological process and signaling pathway.

Keywords Achyranthes bidentata; PCOS; Kidney deficiency and blood stasis; Network pharmacology; Components; Targets; Pathways; Enrichment analysis

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.22.003

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovarian Syndrome，PCOS）是影響女性最常見的內分泌紊亂疾病，在育齡女性中的發病率為5% ～20%，近年呈不斷上升趨勢。PCOS主要特征包括月經周期紊亂、高雄激素血癥和肥胖等臨床綜合征[1]。PCOS的發病機制及其相關的癥狀雖有待解釋，但癥狀和體征上的異質性提示其不可能是單一因素引起[2]。PCOS的發生不僅受遺傳影響，也和下丘腦-垂體-卵巢軸調控功能紊亂、高胰島素血癥、肥胖、精神、心理、環境等因素密切相關[3]。中醫藥辨證論治的個性化方案在治療多囊卵巢綜合征方面有其獨到之處。通過收集古今中醫名家治療多囊卵巢綜合征疾病或癥狀的方劑加以整理，運用中醫傳承輔助系統進行數據分析發現，中醫治療PCOS證候組合中，以腎虛血瘀型和肝郁腎虛型最多，腎、脾、肝三臟功能失調是PCOS主要病機，補虛和解郁是治療PCOS的思路，而補腎健脾、疏肝解郁、理氣化痰、活血化瘀是治療PCOS的主要治法[4]。在治療PCOS的活血化瘀方劑中，牛膝的使用頻次較高，且其具有逐瘀通經，補益肝腎，強筋壯骨，利尿通淋，引血下行的功效。故本研究采用網絡藥理學方法分析牛膝的化學成分、靶點和通路之間的關系，試圖從整體層面揭示牛膝治療PCOS的藥理學機制。

1 資料與方法

借助中國中醫科學院研制的中醫傳承輔助平臺（2.5版本）建立多囊卵巢綜合征方劑數據庫并進行數據挖掘[4]，數據庫收集130位現代醫家的352個方劑，通過對腎虛血瘀型方劑運用熵聚類法進行關聯分析，發現在同時具有補腎和活血功效的中藥中，牛膝的使用頻次最高，故對其開展網絡藥理學的相關研究，揭示其治療PCOS的藥理學機制。

2 結果

2.1 牛膝活性成分篩選及其潛在靶點預測 中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）作為目前國內較為完善的草藥成分靶點數據庫，共收錄了505味草藥的12 144個活性成分、關鍵藥物動力學（ADME）性質、類藥性、作用的靶點、參與的通路及相關疾病，為中草藥的性質檢索、新藥開發和中醫藥基礎理論的現代闡釋提供了新手段和新方法。進入TCMSP平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），選擇Herb name，輸入“niuxi”，獲得176個化學成分，然后根據口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）進行篩選，設為OB≥30%，DL≥0.03，去重后最后得到牛膝活性化合物30個。見表1。另外，oleanolic acid的OB值接近30%（29.02），因其為牛膝的主要成分特根據文獻補入。同時在TCMSP中獲得24個化合物的535個潛在靶點（其中有7個化合物無靶點），篩去重復項，經整理得到128個靶點。

2.2 藥物與疾病共靶點及化合物-靶點網絡 NCBI是一個關于分子生物學、生物化學和遺傳學知識的存儲和分析的數據庫。進入NCBI基因數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），以“polycystic ovarian syndrome”為關鍵詞檢索，選擇種屬“人類”，得到228個PCOS疾病基因靶點。

將牛膝與PCOS疾病靶點分別錄入Excel建立文檔，通過比對找到兩者的共有靶點22個，涉及化合物23個，這些可能是PCOS的主要作用靶點。見表2。將共靶點及其對應化合物數據導入Cytoscape3.7.0構建化合物-靶點（CT）網絡。見圖1。45個節點代表化合物和靶點，111條連線代表化合物和靶點的關系，每個靶點涉及的化合物均值為4.83，每個化合物涉及的靶點均值為5.05，涉及4個及以上靶點的化合物有13個，最多的有17個靶點。涉及5個及以上化合物的靶點有7個，最多的涉及19個化合物。這13個化合物和7個靶點很可能與PCOS關系最為密切。

2.3 共靶點蛋白互作網絡 藥物作用既可以表現為直接的靶點結合和單一的信號通路，也可以是直接靶點和間接靶點共同調控等多靶點、多通路、多層次的復雜網絡模式。因此通過蛋白之間的相互作用關系即PPI網絡可以進一步深入分析藥物對PCOS的重要影響。進入String數據庫，點擊Multiple Proteins，輸入22個共靶點，種屬“人類”，設置評分為0.4，網絡邊緣含義為“molecular action（分子作用）”，得到蛋白互作特征網絡。見圖2。節點數為22，邊數為97，平均節點度為8.82，局部聚類系數為0.676。PPI富集P值<1.0E-16。這意味著蛋白質之間的相互作用比基因組中隨機的一組相似大小的蛋白質所預期的更多，即蛋白質之間的活躍度較高。

2.4 靶點通路注釋分析 通過OMICSHARE（http：//www.omicshare.com/）在線工具動態GO富集分析得到GO富集236條，設置參數為FDR<0.05，P<0.05，獲得GO條目133個。見表3，圖3。其中生物途徑（BP）前5個為細胞壞死、細胞凋亡、細胞增殖、細胞調控翻譯、細胞分化。分子功能（MF）前5個為酶結合、蛋白質結合、脂質結合、DNA結合、核酸結合。細胞定位（CC）前5個為細胞外間隙、細胞外區域部分、胞質部分、核內體、胞外區。通過OMICSHARE（http：//www.omicshare.com/）在線工具KEGG富集分析得到KEGG信號通路富集90條，設置參數為P<0.05，得到KEGG條目17條。見表4，圖4。同時借助Cytoscape3.7.0構建靶點-通路網絡。見圖5。

3 討論

網絡藥理學（Network Pharmacology）是一門從生物網絡的角度研究疾病的發生和發展的過程，認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發現的學科。在研究工具上，該學科借助高通量組學數據、分子網絡數據以及計算機模擬分析，研究藥物的作用機制和促進藥物創新[5]。而中醫的整體觀念、辨證論治理論與網絡藥理學的系統動態觀高度一致，因此，運用網絡藥理學方法研究中醫方藥的作用機制成為目前藥理學研究的一個熱點[6]。本研究通過數據挖掘PCOS腎虛血瘀型方劑核心藥物牛膝，借助系統藥理學、藥代動力學和生物信息學方法來確定牛膝的活性化合物及與PCOS相關的靶點和通路。

本研究通過TCMSP平臺的OB和DL篩選，獲得牛膝的23個化合物和128個靶點，發現其中靶點最多的是槲皮素（87個靶點）和山柰酚（55個靶點），其次是β-谷甾醇、豆甾醇、漢黃芩素、β-蛻皮甾酮、齊墩果酸等。有研究發現槲皮素具有降低體質量和卵巢直徑，恢復卵泡腺外層及黃體功能的作用，并證實其具有減輕多囊卵巢綜合征患者性激素和代謝紊亂的作用[7]。Neisy等[8]研究表明：槲皮素能顯著減少PCOS-IR和顯著誘導子宮GLUT4和ERα基因的表達。口服補充槲皮素可以降低多囊卵巢綜合征超重或肥胖患者的抵抗素血漿水平和基因表達以及睪酮和LH濃度[9];Rezvan等[10]發現口服槲皮素能上調脂聯素受體和AMPK的表達，改善PCOS患者的代謝特征。王針織研究表明，槲皮素可通過抑制TLR/核因子-κB信號通路，達到改善多囊卵巢胰島素抵抗微環境炎性反應，從而逆轉胰島素抵抗[11]。槲皮素已被研究證實在治療PCOS的肥胖和代謝綜合征中發揮了有益的作用[12]，其可能是治療多囊卵巢綜合征患者胰島素抵抗、不孕癥及其近期、遠期并發癥的一種有效的治療方法[8]。山柰酚作為一種可抑制腫瘤發生的黃酮類化合物，可能是通過上調PTEN，失活PI3K/AKT通路，誘導細胞凋亡和自噬而發揮作用[13]。山柰酚還能部分抑制內質網應激反應和炎性反應，有顯著增加絲氨酸的磷酸化胰島素受體底物1（IRS）、C/EBPα及luconeogenic基因的表達，對內質網絡應激引起的炎性反應和高血糖有一定的保護作用[14]。Alkhalidy等[15]研究發現，山柰酚增加了Akt和己糖激酶活性，降低了丙酮酸羧化酶（PC）和葡萄糖-6磷酸酶活性，認為山柰酚可能是一種天然存在的抗糖尿病化合物，有抑制葡萄糖的產生和改善胰島素敏感性的作用。相關臨床與實驗研究表明，β-sitosterol（β-谷甾醇）具有抗糖尿病、調脂、抗癌、抗風濕等作用[16]。β-谷甾醇能干擾多種細胞信號通路，包括細胞周期、凋亡、增殖、成活、侵襲、血管生成、轉移和炎性反應等[17]。漢黃芩素可直接或通過基因誘導細胞凋亡[18-20]、抗新生血管生成[21]。蛻皮甾醇可以改善微循環、抗氧化及保護內皮細胞、降低毛細血管通透性、增強機體免疫功能和調節血管舒縮。陳秋等[22-23]研究發現蛻皮甾醇在體外可通過肝細胞發揮非胰島素依賴的降糖作用，增加胰島素的敏感性并能明顯改善糖代謝。齊墩果酸（OA）是天然三萜類化合物，具有抗糖尿病活性、抗氧化、抗腫瘤[24]、調節血脂和抗炎活性的糖苷配基[25]。有人提出OA可以保護免受氧化應激誘導的HUVEC細胞凋亡，這與AKT/eNOS信號通路有關[26]。OA明顯減弱了Aroclor 1254誘導的胰島素抵抗和葡萄糖和脂質參數的異常變化;OA可通過HNF1b介導的氧化還原穩態調節來抑制PCBs混合物誘導的氧化損傷和葡萄糖及脂質代謝功能障礙[27]。齊墩果酸可通過IRS-1/PI3K/Akt信號通路改善大鼠果糖過度消耗引起的脂肪組織胰島素抵抗[28]。

牛膝藥靶網絡和PCOS網絡有22個重疊基因，富集于90條通路。其中有5個靶點富集的通路有非洲錐蟲病、甲型流感、瘧疾、糖尿病AGE-RAGE信號通路、核因子-κB信號通路、類風濕關節炎、TNF信號通路、HTLV-I感染、癌癥通路等，細胞因子中的腫瘤壞死因子（TNF）超家族是一類多功能炎性反應遞質，可激活與細胞成活、凋亡、炎性反應和細胞分化相關的信號通路。其中TNF和核因子-κB信號通路在PCOS的發病中發揮了重要的作用。一項研究顯示TNF-α可增加其自身信號傳導途徑相關分子的表達（P<0.05），并降低脂聯素及其相關分子的蛋白質水平（P<0.05）[29]。此外，TNF-α增加了核因子-κB的核含量，而核因子-κB抑制劑未觀察到TNF-α誘導的脂聯素含量降低。TNF-α處理后GLUT-4表達水平較低（P<0.001）。因此，在人子宮內膜基質細胞中，TNF-α高水平可通過降低脂聯素信號傳導和GLUT-4蛋白質的表達，進而對胰島素作用產生負面影響。另一項研究顯示：lncRNA SRA改變了胰島素釋放，減輕卵巢損傷，并減少小鼠PCOS中血管生成因子的產生[30]。此外，靶向lncRNA SRA的shRNA抑制了PCOS小鼠和原代顆粒細胞中卵巢中DHEA誘導的炎性反應遞質產生和核因子-κB的核轉位。根據化合物靶點對應關系，牛膝的23個化合物中，指向ESR1和AR靶點的化合物最多，都為19個，其他靶點涉及的化合物為：GSK3B（12個）、ESR2（11個）、PPARG（11個）、ADRB2（9個），因此，ESR1、AR、GSK3B、ESR2、PPARG、ADRB2可能是牛膝在PCOS治療中涉及的關鍵基因。一項研究顯示，與健康女性相比，來自PCOS女性的卵泡中ESR1基因的表達較低;ESR1多態性與胰島素抵抗指數和FSH水平的關聯，強調了ESR1作為PCOS表型的遺傳修飾物的重要性[31]。一項為了評估PCOS參與的雄激素受體（AR信號候選基因）基因的研究中顯示[32]：許多研究報道了雄激素受體（AR）基因多態性CAG重復序列與PCOS發生的相關性，而該薈萃的分析表明AR基因的CAG長度變化與PCOS的發生無明顯的關聯，而CAG長度似乎與PCOS患者的T水平正相關。另有文獻研究對比發現牛膝有多種潛在功能，其中止痛、清熱解毒、逐瘀通經及消癥功能得到現代臨床和實驗研究的證實，具有一定消炎止痛、抗病毒、抗腫瘤的作用[33]。Xia等[34]發現在AR基因外顯子1中（CAG）n的較短等位基因，可能通過上調AR的活性而引起雄激素過多癥，進而增強了對PCOS的易感性。Peng等[35]研究發現雄激素受體（AR）基因第一外顯子區域rs6152G/A多態與PCOS明顯相關。Mifsud等[36]通過92個PCOS患者和112個正常對照組研究發現在AR基因的外顯子1區短的CAG重復序列的長度與無排卵的PCOS患者的低血清雄激素水平有關。Hickey等[37]研究發現AR基因的外顯子1區CAG多態和甲基化程度與PCOS的發生發展有關。

牛膝治療PCOS具有多成分、多靶點的特點，是分子間協同作用的結果，通過干預分子網絡、生物過程及信號通路等機制，其對PCOS的治療主要是通過補腎活血化瘀以發揮抗炎、抗腫瘤、調節血脂、促進微循環及改善胰島素抵抗等作用。通過對牛膝靶點成分藥理作用及其可能機制的回顧，發現其可能通過多種信號通路、細胞凋亡、免疫抑制等途徑發揮其抗糖尿病、調脂、抗腫瘤、抗炎等作用。目前，關于多囊卵巢綜合征發病機制的研究表明，其多與糖脂代謝紊亂，卵泡顆粒細胞凋亡受阻、細胞炎性反應因子等有關。因此，我們對牛膝化合物成分-PCOS靶點的研究將為中藥治療PCOS提供藥理學的理論支持。

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（2019-08-22收稿 責任編輯：楊覺雄）